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不同条件下活性载体提取甜瓜中的核酸 核酸是生物遗传的物质基础。这是合成蛋白质和结合细胞的重要生理活性物质。近年的研究还发现核酸有提高免疫力、记忆力、抗衰老等作用。 我国有着丰富的海洋资源,鱿鱼是我国捕捞量较大的海产品。鱿鱼内脏中肝占有很大比重,而肝是含核酸最多的器官。科学合理地开发利用海洋资源对促进我国经济发展,提高人民健康水平,解决环境污染等重大问题都将具有重要意义。为此,本实验室构建了活性载体并摸索了其工艺的最佳条件,可以方便且较高效率的提取核酸。 1 材料和方法 1.1 材料表面 鱿鱼肝脏由中国渔业水产总公司所提供,活性载体为本实验室构建,所用试剂均为国产分析纯试剂。 1.2 设备和检测仪器 HZQ-F160全温振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),TDL-5000B冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),722分光光度计(上海第三分析仪器厂)。 1.3 方法 1.3.1 肝匀浆和活性载体混合溶液的制备 称取新鲜鱿鱼肝组织100 g,用匀浆器将之制成匀浆液,加入50 mL蒸馏水,充分搅拌即为肝匀浆,约160 mL,然后均分成16份,用于制备浓度为15%、10%、5%、3%的肝匀浆与活性载体的混合溶液各4份。将每种浓度的4份溶液分别培养24、36、48、72 h,在4 ℃ 4 000 r/min进行离心,分别测定水相和沉淀中核酸的含量(核酸含量指RNA和DNA的总量)。 1.3.2 温度对测定酸提取的影响 制备活性载体终浓度为10%的匀浆液6份,分别在20、25、30、37、40、42 ℃进行培养,36 h后测定其中核酸的含量。 1.3.3 ph值对沉积物提取的影响 制备pH值为4、5、6、7、8、9、10、11的肝匀浆与活性载体的混合溶液,培养36 h后测定其中核酸的含量。 1.3.4 肝匀浆与活性载体混合对肝匀浆蛋白含量的影响 在250 mL无菌摇瓶中分别加入25、50、50 mL的肝匀浆与活性载体的混合溶液,分别记为A、B及C组,其中C组充以氮气造成无氧环境,均在37 ℃培养,并测定其中的核酸含量。 1.3.5 模拟高温照射条件 制备30份新鲜肝组织与蒸馏水2∶1混合而成的匀浆,分别装入30个经过消毒的摇瓶;分成A、B、C三组,10个为一组。准备2个暗箱,一个提供黑暗条件,一个内置40 W的日光灯管以模拟日光照射条件。将3组摇瓶按照以下要求分别置于不同的暗箱中:A组24 h置于黑暗中,B组给予12 h持续日光灯照射另12 h处于黑暗中,C组24 h给予日光照射,分别测其核酸含量。 2 结果 2.1 活性载体浓度对核酸含量的影响 水相中的核酸在载体浓度为10%、培养36 h的时候含量最高,但沉淀中的核酸却是在培养72 h、浓度3%时含量最高。由于沉淀中核酸的最远低于水相中核酸的含量,故总的来说,在培养36 h、活性载体浓度10%的时候可以使核酸的产量达到最大。沉淀和水相均可以进一步纯化。经我们摸索和对比,用乙醇、醋酸钠处理效果比较好。 2.2 温度对测定酸提取的影响 在20~37 ℃,温度升高,载体活性增强,所能提取的核酸量也增高;但37 ℃以后随着温度的升高,载体活性下降,核酸的提取量也下降。 2.3 不同ph值对沉积物提取的影响 在pH为3以下和pH为9以上的培养基中,活性极低;而在pH=6.0左右时载体活性比较强,核酸的产量最高。 2.4 核酸量 在不同装样量的条件下,每10 mL培养液所能提取的核酸量:A组53.8 mg,B组98.1 mg,C组132.7 mg。可以看出当培养液充以氮气时即无氧状态时核酸含量最高,可能活性载体为一厌氧型载体。 2.5 不同照明条件下提取酸酸的影响 经过观察三组摇瓶中活性载体的生长情况并测核酸含量结果见表1。经统计分析提示:24 h在黑暗中培养后提取核酸量最高,且具有显著性。 3 活性载体法提取核酸的最佳条件 目前,提取核酸有多种方法,一般均为化学方法。本研究是在核酸的提取过程中运用本实验室构建出的一种新型载体——活性载体,使核酸的提取过程简化,提取量增加。我们首先根据经验,使其在37 ℃、培养基pH近中性的条件下,培养一定时间,从而得出最佳培养时间及载体浓度;然后进一步探讨光照、培养液氧溶量、pH值、培养温度等因素对核酸提取量的影响,发现把10%活性载体与肝匀浆的混合液在黑暗条件下、无氧、37 ℃、pH值=6.0的培养基中培养36 h后,测得水相及沉淀中的总核酸含量最高,而且水相中的核酸含量较沉淀中为高。分析原因可能为:所提取的核酸是以RNA为主。RNA主要存在于细胞质中,DNA主要存在于细胞核中,经活性载体处理后细胞质中的RNA被释放入培养基中而大部分DNA仍位于细胞核中,再经离心处理则水相中RNA含量高,沉淀中DNA含量高;又由于RNA在细胞中的含量比DNA高,所以水