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中华蚊母遗传多样性和遗传结构分析 中国母树（fr.）是属于金缕梅科的一种优良的木兰。它通常被称为水枭科，是一种常绿灌木。根系发达，盘状，有关节和硬度。它可以生活在水中几个月。这是河流固定土壤和护岸的良好树种，也是最好的盆栽树种。中华蚊母除了贵州茂兰有少量分布外,主要分布于长江三峡库区湖北区域(宜昌、巴东、秭归、长阳)和重庆(巫山、黔江、酉阳、 丰都、武隆、江津)一带。随着三峡工程的建造,大部分中华蚊母群落将伴随着三峡库区原有消落带的消失其原生境也被淹没,再加上人类的过度采伐,大面积的中华蚊母已经很少见,现存的中华蚊母仅零星分布在库区河谷、溪流两侧。因此对其遗传资源的研究及保护工作十分必要。宜昌三峡植物园自2002年开始对中华蚊母进行抢救性的迁地保护,建立了中华蚊母的迁地保护居群。 目前对中华蚊母的研究较少,仅见中华蚊母群落、扦插繁殖及水淹胁迫生理生化特性的研究,对其自然居群和迁地保护居群的遗传结构和遗传多样性研究尚未见报道。本研究采用ISSR分子标记技术,对分布于三峡库区湖北区域的中华蚊母的遗传多样性和居群遗传结构进行分析,比较和评价迁地保护居群和自然居群的遗传多样性水平,为进一步制定迁地保护和群体恢复重建的策略 提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 自然居群采样及生境调查 根据遗传多样性研究方法和要求取样,于2008年3~4月赴湖北省内巴东县沿渡河镇、秭归县香溪镇、宜昌市乐天溪镇及长阳县高家堰镇4个自然居群和宜昌市三峡植物园1个迁地保护居群进行采样,同时对各居群生境进行了调查(表1)。为保证取样的可靠性,样本间距在5 m以上。每个居群随机采集8~10株幼嫩叶片,共48个样本。样品用硅胶干燥保存,带回实验室置于4℃冰箱保存至1个月内完成电泳实验。 1.2 方法 1.2.1 pcr扩增检测 采用Doyle等的CTAB法提取DNA,其浓度和纯度用Bio Photometer plus核酸蛋白测定仪检测,260 nm/280 nm的吸光度(OD)比值在1.8~1.9之间的DNA用于ISSR扩增反应。 1.2.2 utaq酶活性离子测定 ISSR引物是根据加拿大British Columbia大学公布的序列设计,由上海生工生物技术有限公司合成。从100对引物中筛选出8对扩增条带较多、亮度清晰的引物,引物序列 见表2。扩增反应体系为20 μL,包含1×PCR buffer,模板50 ng,1 mmol·L-1Mg2+浓度,0.15 mmol·L-1dNTPs,0.6 μmol·L-1引物,0.5 UTaq酶。PCR反应程序为94℃预变性5 min;进行35个循环的94℃变性30 s,54℃复性45 s,72℃延伸90 s;72℃延伸7 min,4℃保存。 PCR产物加入5 μL loading buffer,分别在含有EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳,在BIO-RAD凝胶电泳成像分析系统上照相。 1.2.3 遗传多样性分析 根据电泳图谱中DNA条带的有无,将ISSR扩增结果转化为二元数据(有带的量化为1,无带的量化为0,仅记录清晰且长度在200~1 800 bp范围的扩增带) ,构建二元数据矩阵。应用POPGENE version 1.32软件对全部居群和各单个居群分别进行遗传多样性指数分析:多态位点百分率(PPF)、Shannon信息多样性指数(I)、等位基因数(A)、有效等位基因数(Ae)、Nei’s基因多样性指数(Hp)、种群总遗传变异(Ht)、种群内遗传变异(Hs)、种群遗传距离和遗传相似度、居群间遗传分化系数(Gst)、基因流(Nm)分析。将采用POPGENE version 1.32软件计算得到的Nei等的遗传距离带入NTSYS-pc 2.10软件对各个居群间进行UPGMA聚类分析。利用SAS 9.0软件对中华蚊母所有48个样品ISSR多态性条带进行主成分三维散点图分析(PCA)。 2 结果与分析 2.1 引物扩增多态性 采用筛选得到的8个多态性较高的引物对中华蚊母5个居群48个样本进行PCR扩增,共47条带,平均每条引物扩增出5.9条带,片段大小为150~2 000 bp,其中的多态性条带为44条,平均每条引物扩增的多态性条带为5.5,平均多态性条带百分率为94%(表2)。结果表明该物种具有丰富的遗传变异。图1为引物UBC808对部分参试材料扩增的电泳图谱。 2.2 推行无砂受精基因多样性指数分析 中华蚊母遗传多样性分析结果见表3,中华蚊母物种水平的多态性条带百分率(PPF)为100%,等位基因数(A)为2,有效等位基因数(Ae)为1.370 8,Nei’s基因多样性指数(Hp)为0.237 9,Shannon信息多样性指数(I)为0.386 8,表明中华蚊母物种多样性水平较高。 居群多态性条带百分率在68.8%~78.