琼脂糖电泳技术2.pptxVIP

缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 ( ) 很高 较慢 低 量 量 高 常常用用 贵贵，，不不 价价格格昂昂 高高 分分子子 高 量 高高 分分子子 AA 螺螺 合合 杂杂 NN 超超 混混 复复 旋旋DD 物物；； DDNNAA 高高度度 高高 分分子子 00％％ 快快 高高11 最最 电泳缓冲液比较 n 凝胶中核酸染色方法： 溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法 前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用 后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用 n 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％ n 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道 DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳 结束后用EB染色 n 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中， 室温下30-45min 。 染色完毕后通常不需要脱色。 在检测 小量DNA(10ng)时， 需要脱色， 具体方法为将染色后的 凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中， 室温脱色20min 琼脂糖凝胶中DNA的检测 n 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大 分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm 。 但对 于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 n 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果 表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 电压 n 2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长 n 3、EB含量要适当 n 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳 液，再熔化 n 5、检查梳子 n 6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度 n 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出 n 1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液 ( 一些 限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移， 并可使临近孔泳带变斜) 凝胶制备的注意事项 n 电泳时间不易过长，对于长片断影响不大， 但对小片断DNA影响明显 n 电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方 向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量 显著较少，小片断DNA检测发生困难 n PCR产物，应该在24h之内电泳 电泳时间 1、加样时应悬空 2、加样尽可能快 3、不必每一个样品用一个吸头 4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯 月亮” n 中号梳子：8—10ul n 小号梳子：6—8ul 电泳上样量 n 上样注意事项：