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sybrlifei荧光pcr快速检测登革热病毒 病毒：由于白象病毒和埃及病毒的传播，它被称为病毒科黄病毒科黄病毒家族的成员。根据e蛋白的抗原性，血液清算机分为i、ii、iii和iii类。DEN 感染人类不仅可引起登革热(Dengue fever,DF), 还可引起登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF) 和登革休克综合症(Dengue shock syndrome,DSS),可导致30%～40%的患者死亡。据估计全世界每年登革热发病人数约6 千万,受威胁人口约25 亿,已成为世界上分布广、发病率高、危害较大的一种虫媒病毒性疾病,成为全球性重要公共卫生问题。登革热病毒主要流行于热带及亚热带地区,近年来我国东南沿海地区尤以广东多次发生登革热流行。因此,卫生防疫部门务必要加强登革热病毒检测预警。DEN 的经典诊断方法为病毒分离,但该方法周期长。SYBR Green是结合于双链DNA 的荧光染料, 可在定量PCR 反应时与双链PCR 产物结合放出荧光信号, 被仪器系统实时监控并检测。目前SYBR Green 荧光定量PCR 方法在传染性疾病的诊断等方面有重要的应用价值。本研究根据CLWSTAL软件对DEN基因4个型进行对比分析,设计通用引物,建立了SYBR Green I 荧光PCR 方法, 并研究了该方法的灵敏度、特异性以及重复性,报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.2 样品 1.3 引用产品 1.4 real-timepcr 1.5 pcr反应条件 方法参考Lanciotti RS,Calisher CH,Gubler D检测方法。 总反应体系为20μl。内含:2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 10μl;上游引物、下游引物(10 μmol/μL)各1μl, 终浓度为015μmol/μl;QuantiTect RT Mix 0.12μl;模板1μl;无RNase水6.8μl。反应条件为:50℃ 20min ( ×1),95℃ 10min ( ×1),94℃ 15s→59℃ 20s→72℃30s( ×45) 测定吸光值,即在每个循环结束后测定吸光值。随着PCR 系统在每一个循环结束后测定吸光值,得到以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标,Ct 值为纵坐标的标准曲线。 1.8 曲线色散曲线的测定 1.9 1.10 特异性实验 1.11 敏感实验 1.12 重复实验 2 结果 2.1 个循环结束时ct值的变化 各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值,接下来一直到第5 个循环结束时都没有明显变化。从第6 个循环开始其中的一个反应的吸光值增大,定量曲线开始抬头,15 个循环(Ct 值) 后,曲线迅速上扬,至第30 个循环前后达到峰值,随后进入平台期,一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线(图2)。 2.2 曲线曲线 标准阳性株的熔点峰都在80 ℃左右,曲线平稳,峰尖且窄。阴性对照无RNase水只在73 ℃附近出现一个熔点峰。 2.3 琼脂糖凝胶电泳结果 产物DNA片段大小与目的片段大小一致(图3),测序结果经NCBI-Blast对比为DENGUE序列。 2.4 实时荧光信号检测 用登革热病毒4个基因型SYBR Green I进行实时PCR检测到荧光信号,HCV、HEV、HIV的RNA提取物为对照模板进行SYBR Green I进行实时PCR未检测到无荧光信号。 2.5 实时荧光定量pcr检测 对阳性样本以10倍梯度进行稀释,然后以各稀释液为模板进行SYBR Green I进行实时PCR检测,荧光信号随样本浓度下降而下降,可以检测的范围为10-4数量级。 2.6 标准品产业 重复测定阳性RNA五次,分别得到五个Ct值,Ct平均值分别是15.74、20.83、25.76、28.51、32.32,标准差分别是0.06、0.08、0.64、0.24、0.28,变异系数分别是0.37%、0.40%、2.49%、0.83%、0.86%,显示随着标准品拷贝数的降低,Ct 值增大,标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。 3 实时荧光定量rt-pcr方法的应用 迄今,登革热病毒的检测最原始、经典的方法是特异性病毒分离培养,但由于操作繁琐、技术难度大耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题,在实际工作中难以推广应用。ELISA法与病毒分离培养及基因检测法相比,会产生一定的假阳性。近年来实时PCR检测技术的推广应用给登革热病毒检测提供了可靠的理论和实践基础。实时PCR技术保持了传统PCR检测技术的灵敏性等优点,又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。而且还有重复性好、省力、快速等优