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neurian对大鼠脊髓损伤后神经元修复与再生的影响 控制神经塑性 神经中枢神经系统的损伤和损伤一直是临床难题之一。目前，神经激素（ntfs）的临床治疗主要是营养因子（ntfs）。根据实验，神经营养因子可以为神经重建提供良好的微环境，这在防止神经退变和促进神经波动方面发挥着非常重要的作用。它们在维持神经元存活、促进神经生长和分化及调节突触形成与可塑性的过程中起着重要作用。而Neuritin是一种新的与神经可塑性相关候选15(CPG15,candidate plasticity-related gene15)的神经营养因子。已知Neuritin是神经活动和NTFs发挥作用的共同下游因子,与神经可塑性密切相关。Neuritin是NGF发挥促进神经突起生长作用的一个关键因子。基于Neuritin的功能和对神经系统病变的作用,本实验经过蛛网膜下腔置管将Neuritin移植到脊髓损伤局部,检测Neuritin对脊髓损伤后神经元轴突修复与再生的作用。 1 材料和方法 1.1 蛋白、神经中丝、agts和alas公司的抗 Neuritin蛋白为纯冻干粉(99.31%),由本课题组提供,HIS蛋白(His Tags)购自北京博奥森公司;两者在使用时生理盐水稀释至6ug/100uL。神经中丝(NF200)大鼠单抗购自英国Abcam公司;免疫组化SP试剂盒购自北京博奥森公司。 1.2 实验动物分组 健康Wistar大鼠56只,8-9周龄,体重250g~300g,购于新疆医科大学实验动物中心,饲养两周后,将上述56只大鼠分为6组,每组8只。 (1)实验组和对照组各24只Wistar大鼠,设6h组,3d组,7d组,14d组,28d组,56d组;(2)阴性对照组(n=8),实验组(n=24)和对照组(n=24)。 1.3 治疗t0节段 术前大鼠实行单笼饲养一周,提前6h禁食水。备皮,10%的水合氯醛以300mg/kg行腹腔麻醉,麻醉成功后,沿背正中切口暴露T8~T12棘突及椎板,在暴露的脊髓处放自制垫片,以保证受力均匀。采用改良Allen’s打击法,以300gcm(15g×20cm)f造成T10节段急性脊髓损伤,损伤处约20秒后出现水肿、淤血,可见摆尾反射,双下肢及躯体回缩扑动,表明打击成功。充分暴露出T10节段手术视野,蛛网膜下腔插入自制给药导管(内径约0.1mm),,给药端朝向头部,以肝素帽套封口,依次缝合软组织及皮肤。实验组和对照组在术后经导管连续给予Neuritin 100ul(6ug)或HIS蛋白100ul(6ug)一周。阴性对照组只打开椎板不打击,单纯蛛网膜下腔埋植空管。一周后拔除导管。 1.4 大鼠双术后运动功能的观察和评分 采用BBB后肢功能评分标准。各组大鼠分别于各个观察时间点放在75×125cm的开放空间,采用双人、双盲法独立观察大鼠双后肢的运动功能并记录评分。结果以x±s表示。 1.5 髓组织病理学检测 取实验组和对照组的损伤区脊髓组织5mm,10%中性缓冲液在4°条件下固定,常规蜡块包埋,连续切片,切片厚度5um。从样本中随机抽取2张切片HE染色,观察脊髓组织形态学变化。实验组和对照组标本随机选择2张切片,每张切片随机选择4个视野,用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析,测定阳性产物的累加积分光密度值(IOD SUM)和面积(AREA SUM),计算平均密度值(Mean density,IOD/AREA),IOD/AREA值越大表示阳性产物表达越强。 1.6 活性物质的检测 损伤的脊髓组织充分剪碎,加入RIPA裂解缓液裂解,冰上裂解30min后,于4℃离心25min,取上清液,BCA试剂测定蛋白含量后,1xSDS凝胶加样缓冲液调蛋白浓度使各组蛋白含量一致,在100°C水中煮8min使蛋白质完全变性。10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,转NF膜。用含5%脱脂奶粉的1XTBST封闭一小时,用1:2000加入兔抗鼠NF200一抗于4℃冰箱过夜,TBST洗3次,每次10min.1:4000加入辣根过氧化物酶二抗(Sigma Aldrich美国),室温一小时,TBST洗3次,每次10min。用western blot荧光检测试剂盒显示结果与X光片。Epson 1650 photo扫描仪收集图片,用Labwork S图像分析系统对Western blot结构吸光度扫描,以对照组的面积灰度值为100%与实验组进行比较和半定量分析。 1.7 数据处理及统计分析 文章数据采用均数-+标准数表示,用SPSS13.0统计软件进行数据处理,进行单因素方差分析,方差齐时采S-N-K检验,方差不齐采用TamhanesT2检验进行各组间的比较,单因素方差分析,P0.05为有统计学意义。 2 结果 21 bcb评分的不同检测方法 各组BBB评分总体呈