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几种检测纤维素的方法比较 关于木霉等低质量细菌纤维素酶的研究报道很多。已经报告的纤维素酶的测定方法也很多，包括棉线法、滤纸坍塌法、cmc-t阈值降低法、染色纤维法、平板法和羧甲基纤维钠酶活性法。对具有较强对维生素分解能力的微生物（如细菌）的酶活性、酶活性和活性机制的研究较少，因此这些规则不适用于其他低质量的微生物。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。本次实验对报道较多的4种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 光光度计和工物用量 HH-6型恒温水浴锅;22PC型分光光度计;HG1001型电热鼓风干燥箱;FA2004型电子分析天平;UV-2401型紫外双光束分光光度计 1.2 实验方法 1.2.1 试剂的制备 1.2.1. l冰醋酸钠溶液 6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8 mL冰醋酸定容至100 mL，称取27.2 g的醋酸钠溶解并定容至100 mL，将上述两种溶液等体积混合。 1.2.1. 结晶酚溶液的配制 称取3,5-二硝基水杨酸6.3 g于500 mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2 mol/L NaOH溶液262 mL，再加入到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1 000mL，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 1.2.1. 3-3c-na溶液 称取0.625 g羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100 mL。 1.2.2 酶活性测定 1.2.2. 葡糖糖的制备 原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520 nm处的吸光度，得出还原糖的量。 葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2 h至恒重，称取0.1080 g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100 mL。 取16支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,7并作平行实验。由于各种方法反应体系的总体积不同，所以需作不同的标准曲线，所加的量也有所不同。 现以总体积为9 mL体系为例： 摇匀后置于沸水浴中加热5 min后，冷却定容至25 m L。摇匀后以0号管为对照于最大吸收波长处测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 1.2.2. 维素酶液的配制 配制不同浓度的标准酶液：用去离子水100 mL来溶解100 mg纤维素酶（≥1000 IU），配制成1 mg/mL酶液。测定时分别吸取0.1 mL,0.2 m L,0.3 mL,0.4 mL,0.5 mL,0.6 mL上述酶液用水补足至1 mL，即为不同浓度的酶液。 1.2.2. 葡萄糖mol数的检测 滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活(Filter Paper Activity,FPA)。 方法：取1 m L酶液加1 mL 0.1 mol·L-1、pH 4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1×6 cm新华滤纸(50±1 mg)，50℃保温1 h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3 mL DNS试剂显色后稀释3倍，测OD值(520 nm)。OD值越大，说明该菌株的酶活力越强。 酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数； 其中：60为保温时间(酶与底物作用时间，min)； Ew为粗酶液的体积(mL)； u是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。 1.2.2. 粗酶活力测定 原理：纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用标准葡萄糖溶液作标准液，22 PC分光光度计在520 nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活性单位。 取3支带有20 mL刻度的试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。每支样品管中加1 mL酶溶液，置于50℃水浴锅中预热2 min，然后在3支试管中分别加入4 mL已预热至50℃的底物溶液，准确计时5 min取出，每管立即分别加入1 mL 2mol/L氢氧化钠溶液和2 m L DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1 mL酶液。将3支试管放入沸水浴中，5 min后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20 m L，于520 nm处测OD值。 酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数； 其中：5为保温时间(酶与底物作用时间，min)； Ew为粗酶液的体积(mL)； u是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解