免疫原与抗血清制备技术培训ppt课件.pptxVIP

免疫原与抗血清制备 技术 1 第一节 免疫原的制备 一、细胞性抗原的制备 二、可溶性抗原制备及鉴定 三、半抗原免疫原的制备 四、佐剂 免疫原与抗血清制备技术 2 绵羊红细胞的制备流程图 NS洗涤3次 2000r/min NS稀释至 2~5% 摇动 15-20min 免疫原与抗血清制备技术 3 10min 可保存3周 取适量 NS稀释成8~10亿/ml 细菌细胞抗原的制备流程图 免疫原与抗血清制备技术 液体培养或 斜面培养 37℃24h 100℃水浴 2~2.5h 杀菌 O菌体抗原 4 无菌试验 返回 二、 可溶性抗原制备及鉴定 二、可溶性抗原制备及鉴定 •可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 •来源: 组织和细胞，其成分比较复杂。 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定 免疫原与抗血清制备技术 5 返回 装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液 所用材料必须是新鲜或低温保存的 组织和细胞成分混合抗原制备程序 上清液 澄清 去除细胞碎片 及微小组织 去除包 膜或结 缔组织 洗去血迹 及污物 NS内含0.5g／L NaN2 脏器进行灌洗 3000r／min×10min 冷浴中组织剪碎 取上清液 免疫原与抗血清制备技术 6 离心 1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理 细胞破碎技术及评价 免疫原与抗血清制备技术 细胞破碎技术及评价 7 • 常用酶类： 溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 • 方法： 在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。 • 特点： ①此法适用多种微生物； ②具有作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。 免疫原与抗血清制备技术 8 1.酶处理法 1.酶处 理法 • 原理： 因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 • 方法： 将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。 • 特点： 此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。 完 免疫原与抗血清制备技术 9 2.冻融法 2.冻融法 • 原理： 利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生空化作用 (cavitation) 使得 液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩 涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破 碎。超声波使用的频率从1kHz~20kHz不等，间 歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。 •特点： ①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。 免疫原与抗血清制备技术 10 3.超声破碎法 3.超声破碎法 • 原理： 在适当的温度、 pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。 • 常用的有： 十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴(阳离子型)、聚山梨酯 (非离子型)、新洁尔灭等。 • 应用： ①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞。 免疫原与抗血清制备技术 11 4.表面活性剂处理 4.表面活性剂处理 • 蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法 免疫原与抗血清制备技术 12 蛋白质抗原制备 蛋白质抗原制备 • 原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。 • 特点： 用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。 • 应用： 用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等。 免疫原与抗血清制备技术 13 1．超速离心法 1．超速离心法 • 原理： 根