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亨廷顿蛋白相关蛋白1在成年大鼠脑内的分布 蛋白质相关蛋白1（hunteron1，hap1）是第一个使用遗传因子双杂交系统（yeib2）发现的由镇庭顿引起的疾病基因（hunteront群落）发现的相互作用蛋白。HAP1 既能与正常亨廷顿蛋白也能与突变的亨廷顿蛋白结合,HAP1 与亨廷顿蛋白的结合力随亨廷顿蛋白上谷氨酰胺重复序列的扩展而增强。由于HAP1 与亨廷顿病的关系,近年来对HAP1的研究越来越多地受到国内外学者的关注,但关于HAP1在正常大鼠脑内的分布规律国内尚未见报道。本实验采用免疫组织化学方法观察HAP1在正常大鼠脑内的表达情况,为阐明HAP1功能提供依据。 1 材料和方法 1.1 灌注液加入/断头固定 正常SD大鼠5只(河北医科大学动物室提供),体质量200～250g,用0.4%的戊巴比妥钠腹腔麻醉后,剪开胸腔,暴露心,从心尖部插入灌注针至左心室,并剪开右心耳形成灌注液排出通道,从左心室快速灌入37℃生理盐水100～150ml,继以4℃体积分数4%多聚甲醛500ml灌注固定,于30～40min灌注完毕,迅速断头取脑,置4℃体积分数4%多聚甲醛中后固定6h,然移入体积分数20%蔗糖溶液脱水12h以上。将脑置恒冷箱切片机内冰冻做连续冠状切片(片厚约40μm, pH 7.4的体积分数0.01% PBS接片。 1.2 羊血清控制因子igg 切片移入0.1%的Triton-0.03% H2O2溶液中,37℃,30min,PBS漂洗5min×3;3%正常羊血清,37℃封闭30min;加兔抗HAP1B多克隆抗体(1∶60000,购自华中科技大学同济医学院解剖学系组织学与胚胎学教研室),对照实验用羊血清替代一抗,4℃孵育72h, PBS漂洗5min×3;生物素标记生物素化羊抗兔IgG(1∶600, Vector),37℃孵育1h, PBS漂洗5min×3; ABC液37℃,孵育1h, PBS漂洗5min×3; DAB显色:0.05% DAB-0.01% H2O2-TBS缓冲液室温下显色10～20min,镜下观察显色结果,使所有切片背景尽可能一致,然后终止反应,PBS漂洗5min×3;终止反应后裱片,干片,封片。 1.3 横向比较图像 每个部位各取10张切片[参照《The rat brain》(George Paxions Charles Watson)],每一张切片的可比较区域均用CCD 随机拍摄3～5张×40照片,利用软件Photoshop的方格系统计数单位面积的阳性反应物数目。表达水平以+号表示,+++～++++代表高表达,++代表中等强度表达,+代表低强度表达,+/-代表极低水平表达。 2 杏仁核、苯甲冠部及脑中侧核的表达与形态分析 我们用免疫组织化学法显示HAP1阳性反应物在脑内的分布,阳性反应产物主要位于神经元细胞质和突起中,阳性细胞广泛分布于中枢神经系统,包括脊髓、小脑、脑干、间脑和大脑。 在大鼠,其最强的表达(+++～++++)出现在:黑质致密部、黑质外侧部、黑质网状部、副视束内侧终核、乳头体脚、大脑脚基底部、黑质旁核、束间核、后屈束、穹窿、被盖腹侧区、嘴侧线形中缝核、臂旁色素核、红核小细胞部、三脑室乳头体隐窝、乳头体内侧核,外侧部、乳头体内侧核,内侧部、弓状核、乳头体外侧核、齿状回、杏仁海马移行区(图1A);在皮质后内侧杏仁核、联络纵束、臂旁外侧核、外侧隔核背侧部、外侧隔核中间部、外侧隔核腹侧部、下丘脑外侧前核、隔下丘脑核、髓纹、海马、伞状隔核、海马隔核、下丘脑纹核、底丘脑核、交叉上核、视上核、连合下核、连合下器、脊髓前庭核、丘脑室旁核、丘脑带旁核、丘脑中央旁核、下丘脑室周、下丘脑室旁核、内侧隔核、视前内侧核、前连合、下丘脑前区前部、下丘脑前区中央部、交叉后区有中等强度(++)的表达(图1B);蜗背侧核、背侧纵束、前庭内侧核、中缝背核背侧部、中缝背核腹侧部、中缝背核腹外侧部、中央灰质等处的表达稍弱(+,图1C);其余各脑区像嗅球、大脑皮层各区、小脑皮层等处均有表达但强度极低(+/-,图1D),Stigmoid 小体数目的变化趋势与HAP1 基本一致(图1E)。 3 hap1神经元/传导束 HAP1是胞质蛋白,主要分布在微管以及膜状细胞器中,包括线粒体、内质网、管状囊泡,内涵体、溶酶体、突触小泡等。用光学显微镜进行定位,在HAP1阳性神经元中有免疫反应性点。电子显微镜分析显示他们是一种细胞核类似体,被命名为stigmoid小体,它与蛋白质生物合成有关。HAP1是神经元胞质内stigmoid 小体的重要组分,stigmoid 小体是一个没有膜包裹直径为1～3μm的细胞器,由高电子密度的颗粒和原纤维环绕一个中心或偏心的低电子密度的核包裹而成。电镜下stigmoid小体类似于一个巨大的颗粒丝状小体。HAP1最丰富的脑区也