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一常染色体复杂性遗传almae综合征家系col4a3col4a4基因突变分析 综合征，也称为先发性肾炎，是一种主要影响肾脏的疾病。临床上AS主要表现为患者反复血尿、蛋白尿以及进行性肾功能衰退, 可伴有眼部疾病和感音神经性耳聋等肾外表现。目前认为AS的发病机制与编码肾小球基底膜上Ⅳ型胶原α3、α4和α5链的基因突变有关, 且具有遗传异质性。其中, 编码α5链的COL4A5基因突变可导致性连锁AS (XLAS, 约占85%) ;编码α3和α4链的COL4A3及COL4A4基因突变可导致常染色体隐性AS (ARAS, 约占14%) 和常染色体显性AS (ADAS, 约占1%)。国内关于ADAS相关基因突变的报道较少。该研究对一ADAS家系的COL4A3/COL4A4基因突变进行了分析。 1 对象和方法 1.1 肾活检病理组织学检测 先证者 (Ⅲ5) , 男, 21岁, 听力下降6 a余, 以“颜面浮肿半个月”为主诉入院, 半个月前受凉后出现咳嗽、咳痰。检查示, 尿红细胞90~100/HP, 异性红细胞比例60%, 为肾小球源性血尿;24 h尿蛋白定量5 g。血肌酐146μmol/L, 尿素氮8.64 mmol/L。彩超示双肾弥漫性损伤。电测听检查双耳为中度神经性耳聋。肾活检病理组织学检查示肾小球系膜细胞和基质轻至中度弥漫性增生, 肾小管上皮细胞灶状萎缩, 肾间质多灶状淋巴细胞和单核细胞浸润伴纤维化。电镜下可见GBM不规则增厚, 节段GBM变薄, 致密层分裂, 伴不规则内外侧缘, 呈“花篮状”改变, 其中可见“电子致密颗粒”。肾活检组织 (图1) Ⅳ型胶原抗α3、α4羟基端非胶原区抗体免疫荧光染色为阴性。该患者AS诊断明确。 1.2 常染色体显微型 对该家系成员进行详细调查, 调查内容包括年龄、性别、肾功能指标以及听觉和视觉, 绘制系谱图 (图2) 。该家系无近亲结婚史, 根据系谱分析符合常染色体显性遗传。在该家系成员中, Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5有不同程度的镜下血尿, 均为肾小球源性。Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5出现蛋白尿;Ⅱ7、Ⅲ3有轻度的神经性耳聋, 先证者Ⅲ5出现了肾功能衰竭, Ⅱ7、Ⅲ3处于肾功能代偿期 (表1) 。Ⅰ1 50岁、Ⅱ3 38岁因肾功能衰竭死亡, Ⅱ1及Ⅱ4均有长期血尿史。 1.3 外周血静脉血的性别分布 知情同意后, 采集河南汉族一常染色体显性遗传Alport综合征家系成员12人外周静脉血, 其中男7人 (Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ2) , 女5人 (Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ1) 。另取50名健康人外周静脉血作为对照。所有血样本采用有机酚-氯仿法提取基因组DNA。 1.4 pcr反应条件 参照文献, 根据COL4A3/COL4A4基因各外显子临近区域的内含子序列, 合成上、下游引物序列。扩增体系25μL, 其中含10×Buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L d NTP 1μL, 10μmol/L正反引物各1μL, DNA Taq酶1 U, 100 mg/L DNA模版3μL, dd H2O 16.1μL。反应条件:95℃预变性2 min;94℃变性45 s, 退火45 s, 72℃延伸45 s, 32个循环;72℃再延伸10 min。扩增后经60 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物, 由美国Invitrogen公司进行双向测序。分析测序结果并与健康人及Gen Bank中序列进行比较。 2 col4a3与col4a4基因 对先证者及该家系中患病者COL4A3/COL4A4基因外显子进行测序, 并与50名健康人测序结果及Gen Bank序列进行对比分析, 共筛选出COL4A3/COL4A4基因8个突变位点, 其中包括1个错义突变、1个内含子突变和6个序列变异。见表2、图3。 COL4A4基因第44外显子的错义突变c.4195AT导致M1399L, 该家系有症状的患者 (Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5) 均出现了此突变, 均表现为杂合子, 而作为对照的50名健康人以及该家系表现正常者中未出现此突变。先证者Ⅲ5第44内含子上出现c.4127+11 CT突变, 其他家系成员未见此突变。 3 adas基因突变 ADAS通常是由COL4A3和 (或) COL4A4基因突变引起, 这些基因定位于2q35~q37, 分别编码构成Ⅳ型胶原的α3及α4链。COL4A3及COL4A4基因突变可导致α3及α4链的异常, 引起Ⅳ型胶原分子结构的改变和功能的缺陷, 进而影响肾脏基底膜的正常网状结构。目前25%~50%AS的突变为甘氨酸取代突变, 甘氨酸被认为是最小的氨基酸, 可以插入Ⅳ型胶原紧密的三螺旋内部, 它的取代突变可破坏螺旋的形成, 进而影响基底膜的结构而导致疾病。ADAS的常见突变包括甘氨酸取代突变、错义突变、剪接位点突变等, 但无明