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gilmann综合征患者ug1a1基因检测及遗传分析 吉尔伯特综合征是一种常见的非结合胆红素血症，也称为功能物质性肝功能不良黄疸。由于肝细胞摄取非结合胆红素（iub）的功能，以及体内葡萄糖乙酸钠转氨酶酶的缺乏，患者的血液中tcb有增加和黄疸。患者主要表现为以间接胆红素升高为主的非溶血性间歇性黄疸,一些患者可出现乏力、消化不良、肝区不适和脂肪不耐受,而疲劳、感染、禁食等均可使患者的胆红素水平明显升高。该病患者实验室检查主要表现为间接胆红素升高,低热卡试验、苯巴比妥试验等能协助诊断,肝脏穿刺病理可确诊。随着分子生物学技术的发展,人们对Gilbert综合征的研究已非常深入。研究发现,UGT1A1基因异常可导致肝脏微粒体的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶表达下降,从而引起胆红素代谢障碍。目前已在Gilbert综合征患者及其家系中发现3种类型的UGT1A1基因异常,包括远端加强序列即苯巴比妥反应增强元件(PBREM)突变、启动子区域TA盒中TA碱基序列插入突变及UGT1A1基因外显子区域的单碱基突变。研究还发现,不同人群的Gilbert综合征存在遗传背景差异。本研究对1例Gilbert综合征患者及其家系进行基因诊断,现报道如下。 数据和方法 一、 dilwell综合征 Gilbert综合征先证者为女性,12岁,汉族,近年反复出现间歇性黄疸,生病或劳累时皮肤及巩膜黄染明显,十余日后黄疸会自行消退。先证者多次发病时的相关检测结果均显示血清胆红素增高,且以UCB为主。结合患者的生化检测结果、病史特点及低热卡试验阳性结果,确诊为Gilbert综合征。征得先证者及其相关家系成员知情同意,采取相关人员的外周静脉血,提取DNA进行基因检测。 二、 dna检测方法 本研究采用的主要仪器及试剂包括全自动生化分析仪(Beckman DxC800)、基因组DNA抽提试剂盒(天根生物公司)、UGT1A1基因8对寡核苷酸引物(桑尼生物有限公司)、PTC-200DNA扩增仪(美国MJ Research公司)、三磷酸脱氧核苷(dNTP)(Takara公司)、PCR反应缓冲液和TaqDNA聚合酶(申能博彩公司)。 三、 pcr扩增及家系研究 1.基因组DNA提取:抽取Gilbert综合征先证者及其家系成员的外周静脉血,参照试剂盒说明提取全血白细胞基因组DNA,置-20℃下保存备用。 2.UGT1A1基因引物序列:选用UGT1A1基因上游PBREM引物、启动子区域TATA盒引物和UGT1A1基因1号(2对)到5号外显子引物,共8对(见表1)。 3.PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳:实验引物浓度为10μmol/L,PCR反应体系总体系为25μL,包括10×缓冲液2.5μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL,10μmol/L引物上下游各1.25μL,TaqDNA聚合酶0.3μL,加双蒸水至总体积25μL。PCR反应条件为95℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,循环30次;72℃再延伸5 min。PCR结束后,取2μL PCR产物,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,纯化后分别对扩增引物测序(上海华大基因研究中心)。结果用Chromas Pro软件比对分析。 4.家系调查和遗传图谱分析:家系调查内容包括性别、年龄、是否近亲婚配、健康状况、肝病史、遗传疾病史、既往肝功能检查结果和胆红素水平、黄疸病史等。结合先证者基因测序结果,检测家系成员同一外显子,分析突变来源和遗传方式,绘制遗传图谱。 结果 一、 uft1a1基因启动子区域的tata盒 将先证者及其家系成员DNA扩增的PCR产物测序结果与数据库序列比对,发现家系成员突变为UGT1A1基因启动子区域的TATA盒(见图1、图2)。且先证者及其胞姐均为UGT1A1基因启动子区域TA盒TA插入的A(TA)7TAA型(纯合型),而先证者的父亲和母亲则在UGT1A1基因的TA盒区域均为A(TA)6/(TA)7TAA杂合型。 二、 家庭家谱 根据测序结果,明确各个家系成员基因型,绘制遗传图谱如图3。 远端加强序列p一、t-339g突变13. Gilbert综合征1901年由Gilbert首先报告,患者的主要临床表现为肝脏无器质性病变的非溶血性间歇性非结合性高胆红素血症。该病患者胆红素大多来源于衰老红细胞的血红蛋白分解,其余部分来自肝内含有血红素的蛋白质。UCB系脂溶性,不溶于水,循环过程中以胆红素-白蛋白复合物的形式随血液流至肝脏,在循环过程中不能经肾小球滤过,故不能经尿液排泄,尿中无非结合胆红素,但可透过血脑屏障,非结合胆红素升高可引起核黄疸造成神经系统损害。结合胆红素为水溶性,可经肾小球滤过而在尿中出现。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)是胆红素结合的关键酶,其对胆红素进行有效转化、分泌和排