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hplc同时测定口炎清颗粒中7个有机酸 口炎清颗粒是一种由五种药物组成的中药产品，包括山银花、玄参、天冬、麦冬和甘草。具有滋阴、清热、解毒、消肿的功效。主要用于由阴虚火引起的口炎。有机酸为山银花和口炎清颗粒所含的主要活性成分,中国药典和文献均是采用HPLC单独测定绿原酸的含量,山银花除绿原酸外尚含有新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸及4,5-二咖啡酰奎宁酸等有机酸。近代药理研究表明绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性,咖啡酸具有抗菌、抗病毒、止血等功效,二咖啡酰奎宁酸类具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血脂及抗HBV及HIV等作用。其均与口炎清颗粒功效相近,且绿原酸类成分在储存过程中其异构体之间会相互转换,单以绿原酸1个成分来衡量其质量有一定片面性,故对含山银花的中成药,应同时测定其所含的多个咖啡酰奎宁酸类成分的含量,试验采用HPLC同时测定口炎清颗粒中上述7个活性成分的含量。该方法简单快速,重复性好,可为该制剂的质量标准提高研究提供参考依据。 1 药品与试剂 DIONEX高效液相色谱仪(P680A四元梯度泵,PDA-100二极管阵列检测器,TCC-100柱温箱,Chromeleon色谱工作站);瑞士Precisa电子天平(XR 205SM-DR)。 新绿原酸(批号070915)、绿原酸(批号080620)、隐绿原酸(批号080923)、咖啡酸(批号071026)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(批号071129)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(批号080530)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(批号071115)均由成都普瑞法有限公司提供,经HPLC峰面积归一化法检测纯度均在98%以上。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。口炎清颗粒,广州白云山和记黄埔中药有限公司,规格:10 g,批号分别为B9A001、D0A012、K9A002。 2 方法和结果 2.1 流动相、流速和检测波长 色谱柱:AkzoNobel Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱(0 min→22 min→25 min,乙腈6%→30%→6%);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:326 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品储备液的制备 取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸及4,5-二咖啡酰奎宁酸的对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加50%甲醇制成每1 mL分别含新绿原酸0.648 mg、绿原酸2.584 mg、隐绿原酸0.638 mg、咖啡酸0.163 mg、3,4-二咖啡酰奎宁酸0.594 mg、3,5-二咖啡酰奎宁酸1.146 mg及4,5-二咖啡酰奎宁酸1.218 mg的混合溶液,摇匀,作为对照品储备液。取此液2 mL,稀释至25 mL,即得混合对照品溶液。 2.2.2 超声过滤形瓶的制备 取本品5.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,超声(功率250 W,频率25 kHz)处理10 min,过滤,即得。 2.2.3 阴性对照溶液 取按处方比例及制备工艺制得不含山银花的阴性样品,按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。 2.3 色谱结果及色谱图 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸及4,5-二咖啡酰奎宁酸与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,拖尾因子在0.99~1.08之间,理论塔板数以各色谱峰计均在20000以上。阴性对照无干扰,即本试验条件下所测的7个成分与其他组分分离完全。 2.4 对照品溶液的制备 精密量取“2.2.1”项下对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置于25 mL棕色量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得系列对照品溶液。分别取10 μL平行进样测定3次,以峰面积平均值A对进样量C(μg)进行线性回归,得回归方程。见表1。 2.5 仪器精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸及4,5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.33%、0.25%、0.29%、0.56%、0.44%、0.39%、0.48%,表明仪器精密度良好。 2.6 重复性试验结果 取同一批样品(批号D0A012),照“2.2.2”项下方法,平行制备6份供试品溶液,分别进样测定,结果新绿原酸