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hplc法测定中药黄山药中伪原薯皂苷的含量 黄山药又称侧柏草和虎杖，是一种常年生长在野生草上的植物。这是中国特有的甘薯科甘薯属植物。它的根茎促进了血液循环，缓解了疼痛。以其根茎提取物(主要为甾体总皂苷)为主要原料的地奥心血康胶囊临床用于治疗冠心病、心绞痛等心肌缺血疾病。目前文献多报道黄山药、穿龙薯蓣和地奥心血康胶囊中薯蓣皂苷的含量测定,有关伪原薯蓣皂苷的含量测定方法尚未见报道。伪原薯蓣皂苷(pseudopro-dioscin)是地奥心血康中含量较高的甾体皂苷成分,也是其活性成分之一,因而是反映药材和制剂质量的一个重要指标。本研究首次建立高效液相色谱法测定黄山药中伪原薯蓣皂苷的含量方法。 1 蒸发光散射仪检测 岛津LC-10Avp液相色谱仪(二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器),安捷伦1100液相色谱仪(四元低压输液泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和Alltech ELSD2000 蒸发光散射检测器),配备相应的仪器工作站;国产实验室纯水机;AND GR202 1/10万电子天平。Merck 色谱纯乙腈;甲醇、乙醇、正丁醇等为分析纯;水为超纯水。 伪原薯蓣皂苷对照品是从地奥心血康原料中分离得到,经波谱分析确定结构。经HPLC以峰面积归一化计,对照品纯度为98.0%。黄山药药材由邓思杨从四川、贵州等地采集,共10 批药材,编号为1~10(表1),均经中国中医科学院中药研究所付桂芳主管技师鉴定为薯蓣科植物黄山药D.panthaica的根茎。 2 方法和结果 2.1 产物的hplc检测 Merck Purospher STAR RP-18e色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相A为乙腈,B为水,梯度洗脱条件:0~25 min,A 30~40%,B 70~60%;25~25,5 min A 40~30%,B 60~70%;25.5~40 min A 30% B 70%。流速1 mL·min-1;检测波长203 nm,进样量10 μL,柱温40 ℃。对照品HPLC图谱见图1。理论板数按伪原薯蓣皂苷峰计算应不低于8 000。 2.2 标准溶液配制 精密称取伪原薯蓣皂苷对照品约1.0 mg,精密称定,置于10 mL的量瓶中,加75%乙醇溶液至刻度,摇匀,制成质量浓度0.102 g·L-1的溶液。 2.3 超声处理w 取黄山药粉末(过四号筛)约2 g,精密称定,置100 mL锥形瓶中,精密加75%乙醇50 mL,称定质量,密塞,放置过夜;超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min;冷却至室温后,再次称定质量,并用75%乙醇补足失重,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,向残渣中加甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,超声1 min促溶,摇匀,滤过,取续滤液,即得。 2.4 方法研究 2.4.1 伪原薯皂苷线性关系的分析 用75%乙醇制备伪原薯蓣皂苷的一系列标准溶液(0.6~2 000 mg·L-1),质量浓度分别为8.624,17.248,43.12,86.24,215.6,323.4,431.2 mg·L-1,分别进样。色谱条件下测定,以峰面积(Y)对照品质量浓度(X)进行线性回归,回归方程为Y=5 862X+6 252,R2=0.999 9,显示伪原薯蓣皂苷在8~400 mg·L-1(进样量10 μL)呈现良好的线性关系,纵轴截距约相当于标准曲线中最低浓度(8 mg·L-1)样品主峰峰面积的10%,或相当于含量测定浓度(100 mg·L-1)样品主峰峰面积的1%,相关系数R20.999 9,证明在该浓度范围内线性关系良好。以对照品样品测定,最低检测限约为0.6 mg·L-1(进样量10 μL)。 2.4.2 对照品溶液配制 精密称定黄山药粉末(过四号筛)2 g,按2.3项下制成供试品溶液,重复进样6次,测定峰面积,相对标准偏差小于0.25%。 对照品溶液在冰箱(4 ℃)中储存14 d后,测量,含量稳定;供试品溶液在室温下(避光)储存48 h内稳定,某些样品在室温下放置48 h以上,或在冰箱中放置3 d后,下层有絮状混浊,但用0.45 μm膜过滤后进样,含量无明显改变。 2.4.3 伪原薯皂苷的测定 取同一批黄山药药材样品(8号样品),按前述样品处理方法平行制备6份,在确定的色谱条件下,进行伪原薯蓣皂苷含量测定,RSD 2.0%,重复性良好。 2.4.4 浓度水平下的加样实验 采用加样回收法,以已测含量样品为本底样品,进行了相当于含量测定浓度的80%(80 mg·L-1)、100%(100 mg·L-1)和120%(120 mg·L-1)3个浓度水平下的加样实验。9次实验评价回收率为99.9%,RSD 2.3%,结果见表2。 2.5 样品含量的测量