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hplc法同时测定银黄含片中10个活性成分的含量 银黄包含由蜂蜜提取物和银杏提取物制成的中药复方制剂。具有清热、祛风、有利于咽喉排毒的功效。它对急性支气管炎和急性咽喉疾病也有治疗作用。金银花提取物是从金银花中提取的有机酸类活性成分,主要为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B及异绿原酸C;黄芩提取物的主要活性成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素。近代药理研究表明异绿原酸类同绿原酸类均具有抗菌、抗病毒活性,而汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素也同样具有黄芩苷的部分药理活性。文献对银黄系列的质量控制主要为采用HPLC测定绿原酸和黄芩苷的含量,鲜有报道银黄含片中其他活性成分的含量检测。另外文献中同时测定绿原酸类6个成分和黄芩苷类4个成分均有一定报道,但同时测定这2类10个成分未见报道。由于绿原酸类成分在储存过程中其异构体之间会相互转换,黄芩苷类也会降解为其苷元黄芩素,单以绿原酸及黄芩苷2种成分来衡量其质量有一定片面性,故试验采用HPLC同时测定上述10个活性成分的含量。该方法简单快速,重复性好,可用于该制剂质量标准提高研究。 1 试剂和检测纯度 戴安高效液相色谱仪(P680A四元梯度泵,PDA-100二极管阵列检测器,TCC-100柱温箱,Chromeleon色谱工作站);瑞士Precisa电子天平(XR 205SM-DR);CQX25-06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司,功率250 W,频率25 kHz)。 对照品新绿原酸(批号070915)、绿原酸(批号080620)、隐绿原酸(批号080923)、异绿原酸B(批号071129)、异绿原酸A(批号080530)、异绿原酸C(批号071115)由成都普瑞法有限公司提供;对照品黄芩苷(批号080721)、汉黄芩苷(批号071008)、黄芩素(批号080316)、汉黄芩素(批号071215)由成都曼思特生物科技有限公司提供。所有对照品均经HPLC峰面积归一化法检测纯度均在98%以上。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。银黄含片(规格:0.65 g·片-1,成都地奥制药集团有限公司生产,批号为0912068、1001059、1004024)。 2 方法和结果 2.1 流动相、检测波长及流速 色谱柱:AkzoNobel Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱,0 min→30 min→40 min,乙腈5%→40%→80%;检测波长:分段变波长测定,0~25 min为326 nm,25~40 min为275 nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;进样量:10 μL。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品储备液 取对照品新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素适量,精密称定,置棕色量瓶中,加75%甲醇制成每1 mL含新绿原酸1.036 mg、绿原酸1.938 mg、隐绿原酸1.020 mg、异绿原酸B 0.788 mg、异绿原酸A 0.764 mg、异绿原酸C 0.812 mg、黄芩苷7.860 mg、汉黄芩苷1.264 mg、黄芩素0.286 mg及汉黄芩素0.138 mg的混合溶液,摇匀,作为对照品储备液。取此液2 mL,稀释至25 mL,即得每1 mL分别含新绿原酸0.083 mg、绿原酸0.155 mg、隐绿原酸0.082 mg、异绿原酸B 0.063 mg、异绿原酸A0.061 mg、异绿原酸C 0.065 mg、黄芩苷0.629 mg、汉黄芩苷0.101 mg、黄芩素0.023 mg及汉黄芩素0.011 mg的混合对照品溶液。 2.2.2 超声辅助过滤法 取本品10片,精密称定,研细,取约0.65 g,精密称定,称定重量,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇25 mL,超声(功率250 W,频率25 kHz)处理5 min,取出,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,取续滤液,以0.45 μm的微孔滤膜过滤即得。 2.2.3 阴性对照溶液 取按处方比例及制备工艺制得不含金银花提取物、黄芩提取物的阴性对照样品,按“2.2.2”项下方法分别制成阴性对照溶液。 2.3 相邻色谱峰的测定 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,拖尾因子在0.97~1.04间,理论板数以各色谱峰计均在20000以上。阴性对照无干扰,即本试验条件下所测的10个成分与其他组分分离完全。 2.4 对照品线性回归法