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分 步 洗 脱 本文档共92页；当前第59页；编辑于星期二\7点2分 (c) 梯度洗脱 本文档共92页；当前第60页；编辑于星期二\7点2分 清洗与再生 弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS、 6-8 M 尿素、 6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂：吐温-80 缓冲液平衡 本文档共92页；当前第61页；编辑于星期二\7点2分 思 考 题 1 理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。 2 不同的层析分类方法各有何意义？ 3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？ 4 亲和层析的机理是什么？ 5 配基偶联后残留电荷对分离有何影响？ 如何消除？ 6 小分子配基为何需插入手臂？ 7 层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？ 本文档共92页；当前第62页；编辑于星期二\7点2分 第8章 色层分离法（第二讲） 本文档共92页；当前第63页；编辑于星期二\7点2分 柱层析分离法的有关装置 本文档共92页；当前第64页；编辑于星期二\7点2分 装 置 ⑴泵 ⑵混合器 ⑶层析柱 ⑷检测器 ⑸记录仪 ⑹分部收集器 本文档共92页；当前第65页；编辑于星期二\7点2分 硅 胶 硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质 （1）化学组成 SiO2.XH20， （2）属于无定形结构，基本结构质点为Si—O四面体，相互堆 积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。 （3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。 硅胶的分类（常以孔径大小来分）， (1) 特细孔硅胶 (0.8nm以下)。 (2) 细孔硅胶（1.5—2.0nm ) (3) 中孔硅胶 (4.0一5.0nm) (4) 粗孔硅胶 (10.nm以上) 应用：吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离， 可用在水溶液中或有机溶剂中 本文档共92页；当前第27页；编辑于星期二\7点2分 琼脂糖 由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 ①中性不带电 ②水溶性线状多糖 ③高亲水性，含大量羟基 ④能制成多孔性凝胶，分离大分子 制备： ① 去除带电琼胶成分 ②将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。 ③采用交联剂增加介质的机械强度 本文档共92页；当前第28页；编辑于星期二\7点2分 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构 a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构 本文档共92页；当前第29页；编辑于星期二\7点2分 琼脂糖（2） 介质商品种类 Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B。 经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 水溶液中分离蛋白质 本文档共92页；当前第30页；编辑于星期二\7点2分 葡聚糖 α-1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒 性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤分子筛 应用：水溶液中分离蛋白质等 本文档共92页；当前第31页；编辑于星期二\7点2分 纤维素 β-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物 （1）亲水 （2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度 大孔珠状纤维素 （1）高孔度 （2）高机械强度 （3 ) 亲水性强 应用：离子交换分离蛋白质介质 本文档共92页；当前第32页；编辑于星期二\7点2分 聚丙烯酰胺 性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰 胺共聚 （2）烷烃骨架与酰胺侧链 （3）控制交联剂比例可控制网格孔度 （4）亲水好，但不如多糖介质 (5) 机械强度差 应用：（1）凝胶过滤 （2） 电泳介质 本文档共92页；当前第33页；编辑于星期二\7点2分 亲和层析 亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。 生物体内相互作用的分子对： (1) 酶—底物或抑制剂 (2) 抗原—抗体 (3) 激素—受体 (4) 糖蛋白与凝集素 (5) 生物素—生物素结合蛋白等 本文档共92页；当前第34页；编辑于星期二\7点2分 基质活化方法与配基偶联 活化(activation): 基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学