高效液相色谱柱前衍生化法测定大鼠腹腔注射给药中5-羟色胺的浓度.docxVIP

高效液相色谱柱前衍生化法测定大鼠腹腔注射给药中5-羟色胺的浓度 盐酸氟西汀是一种选择性的5-羟色胺（5-ht）提取物抑制剂。服用盐酸氟西汀后，大脑中的5-ht含量会增加。5-HT既是一种中枢神经递质,也是一种对各种组织具有局部作用的自身活性物质。脑内5-HT异常可致脑功能和行为失常,5-HT的含量变化也是一些恶性肿瘤发生的信号。测定5-HT的方法有电化学检测的高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法和利用5-HT自身荧光检测的HPLC等。由于这些方法的选择性差,灵敏度低,应用于生物样品的测定时常需要使用液-液或固相萃取等方法除去干扰物质。近年来,有文献报道用1,2-二苯基-1,2-二氨基乙烷(DPE)和吲哚类化合物进行衍生化反应生成荧光衍生物的检测方法,苯甲胺也可以和吲哚类化合物反应生成类似的荧光衍生物。本文考察了在铁氰化钾存在的条件下苯甲胺和5-HT反应的条件,并用柱前衍生化HPLC测定了大鼠腹腔注射(i.p.)盐酸氟西汀后脑纹状体渗析液中5-HT的浓度。实验结果表明该法准确、灵敏度高,简便,适合于渗析液中5-HT的浓度测定,也可推广至其他生物基质的样品分析;能满足临床和科学实验的检测要求。5-HT和苯甲胺的衍生化反应机理见图1。 1 实验部分 1.1 br-2微渗析法 高效液相色谱仪(Hitachi,Japan):L-7300型高压泵,L-7480型荧光检测器;脑立体定位仪(USA);恒速灌流泵(B.Braun,Germany);BR-2微渗析探头(BAS,USA)。5-HT(Sigma,USA);2,3,6-三-O-甲基-β-环糊精(Tokyo Kasei,Japan);乙腈、辛烷磺酸钠(色谱纯);其他试剂为分析纯。 1.2 对照品溶液的制备 5-HT对照品溶液:取5-HT 11.0 mg, 加水溶解并制成浓度为20 μmol/L的贮备液,于-20 ℃保存。使用时用水稀释制备不同浓度的对照品溶液。 铁氰化钾溶液(60 mmol/L):取铁氰化钾98.7 mg,用水溶解并稀释至5 mL,即得。 苯甲胺溶液(300 mmol/L):取经过乙醇重结晶的苯甲胺32.1 mg, 加水溶解并稀释至1 mL,即得。 5-羟色胺衍生化试剂:pH 11,300 mmol/L硼酸盐缓冲液-300 mmol/L苯甲胺溶液-60 mmol/L铁氰化钾溶液-乙腈(体积比为1∶1∶1∶20)。 1.3 脑立体定位法 雄性Wistar大鼠4只,体重350~370 g,由沈阳药科大学实验动物室提供。大鼠在(25±5) ℃的条件下,笼饲养,自由饮食饮水,3 d后进行实验。在戊巴比妥(40 mg/kg, i.p.)麻醉下,固定大鼠于脑立体定位仪上,参照大鼠脑图谱,在纹状体外埋植外套管,并用铆钉和牙用粘合剂固定。术后一周,插入直型微渗析探针(长3.0 mm,内径0.22 mm,截止相对分子质量5000,日本Eicom公司)。用人工生理盐水(含25 g/L 2,3,6-三-O-甲基-β-环糊精)以1.5 μL/min恒速灌流,平衡1 h后,收集微渗析液,作为空白液(-80 min~0 min的渗析液),并于给药(10 mg/kg腹腔注射盐酸氟西汀生理盐水溶液)后每隔80 min收集一次该时间段所产生的微渗析液,置于-80 ℃下保存。 1.4 样品制备 取微渗析液60 μL,加入等体积的衍生化试剂,混匀,取100 μL注入液相色谱仪。 1.5 脑微渗析液化合物5-ht衍生物 色谱柱:Hypersil C18(250 mm×2.0 mm,5 μm);流动相:乙腈-20 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.0)(体积比为45∶55),含20 mmol/L辛烷磺酸钠;流速:1.0 mL/min;柱温:室温;荧光检测波长:λex=330 nm,λem=455 nm。 在此色谱条件下,给药前大鼠的脑微渗析液、5-HT对照品溶液、大鼠i.p.给药盐酸氟西汀后脑微渗析液衍生化后的色谱图见图2。可以看出5-HT衍生物获得了很好的分离,内源性杂质对测定没有干扰。5-HT荧光衍生物的保留时间约为10 min。 2 结果与讨论 2.1 标准曲线的绘制 取0.25,0.50,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 nmol/L 5-HT 对照品溶液各60 μL,分别加入60 μL衍生化试剂进行荧光衍生化,进样,记录色谱峰面积。以5-HT的浓度(X,nmol/L)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,绘制标准曲线,典型的回归方程为:Y=21049X-105.8,r=0.9991。线性范围为0.25~5.0 nmol/L,最低定量限为0.25 nmol/L。 2.2 精密度和准确度 取空白脑渗析液60 μL,按“线性关系”制备含5-HT高、中、低3个浓度(分别为5.0,2.0和0.