大补阴丸牵正散对帕金森病小鼠神经保护作用的实验研究.docxVIP

大补阴丸牵正散对帕金森病小鼠神经保护作用的实验研究 帕金森病（parkinsonsdiew，pd）是一种常见的神经系统退行性疾病。其主要的病理改变为中脑黑质致密带多巴胺(Dopamine,DA)能神经元丢失,引起黑质-纹状体通路多巴DA水平降低。该病以运动减少、肌张力增强和震颤为主要症状。目前对PD的药物治疗主要分为抗胆碱药物和增强DA能神经功能的药物两大类。但是西药长期应用毒副作用较大,且疗效不稳定。传统的中医药用于临床治疗帕金森病已取得了一定的疗效。中医将帕金森病归属颤证,证属本虚标实,以虚为主,虚在肝肾脾三脏,实见风、火、痰、瘀。祛风化痰止痉和滋阴降火潜阳是临床治疗的重要法则,牵正散、大补阴丸是常用方药。根据中医方证对应理论,临床常用经方合方干预。本实验旨在探讨大补阴丸、牵正散及合方对DA能神经元的保护作用,为帕金森病的中药治疗提供实验基础。 1 材料和方法 1.1 动物用药量 中药牵正散组方:白附子、僵蚕、全蝎(去毒)。大补阴丸组方:黄柏、知母、熟地黄、龟板。动物用药量根据成人9倍量算,即牵正散3.51g/(kg·d),大补阴丸7.74g/(kg·d)。合方为1∶1的牵正散和大补阴丸。方药购自同仁堂,水煎后于冰箱保存备用。 1.2 动物分组及处理 选用C57BL/6小鼠,雄性,体重(20±1)g,购于北京维通利华公司实验动物中心,许可证号:SCXK(京)2007-0001。动物给药前,采用爬杆法进行训练筛选,选取四肢并用且一次顺利从杆上爬下的小鼠65只随机分为5组:正常组、模型组、牵正散组、大补阴丸组和合方组,每组13只动物。除正常组外,其余四组分别连续5天,腹腔注射生理盐水配制的MPTP 30mg/(kg·d)(Sigma公司)。模型组造模后不做任何处理存活至14天,牵正散组于注射MPTP 1天后隔天灌胃牵正散至14天。大补阴丸组于注射MPTP 1天后隔天灌胃大补阴丸至14天。合方组于注射MPTP 1天后隔天灌胃1∶1牵正散和大补阴丸至14天。 1.3 其它模拟产物的检测 存活期满后动物断头冰上快速取脑,并从视交叉后1.5mm处做冠状切开,前部脑称重后于-70℃低温保存,用于检测多巴胺及其代谢产物的含量,由于分离出黑质或纹状体质量较小,检测不出多巴胺及其代谢产物的含量,因此我们取整个前脑做这部分的检测;后部脑组织放入用0.1MPB配制的含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶液固定1周后,按常规处理制备石蜡切片,片厚6μ),常温保存备用。采用免疫组化技术显示黑质TH阳性神经元的表达。 1.4 鼠的组织学检测 观察小鼠一般状况和活动,采用爬杆法检测各组小鼠的行为学。所有动物于第一次注射MPTP后进行爬杆实验,每只鼠隔日爬杆1次,连续14天,共测7次,每只小鼠每次爬杆3次,计算平均爬杆时间。 1.5 酪氨酸羟化酶抗体 每组13只动物取6只,采用常规免疫组织化学ABC法显示小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)的表达。酪氨酸羟化酶抗体(TH-16)购自Sigma公司,浓度为1∶400。阴性对照切片不加一抗,其它处理同ABC法,光镜观察切片。每组每只动物选通过脚间核平面的1张切片,每张随机选一侧黑质部位,采用Nikon(Nikon公司)显微镜10倍物镜采集图像,各组切片选取部位尽量一致,分别进行TH阳性细胞计数。 1.6 超微结构的观察 每组13只动物中取另3只,分别采用0.1MPB配制的含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛溶液经左心室升主动脉灌流固定后,取脑,经灌流固定的脑组织后固定3天后,在解剖镜下取黑质致密部组织切成1mm×1mm×0.5mm的小块,放入0.01MPBS冲洗,1%四氧化锇固定,再经缓冲液冲洗,丙酮脱水,环氧树脂浸透包埋,超薄切片,醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色,JEOL-1230型透射电镜(JEOL公司)观察中脑黑质神经元的超微结构。 1.7 高效液相色谱法 取每组13只动物中最后4只动物前脑,运用高压液相电化学技术内标法测定多巴胺(Dopamine,DA)、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-aceticacid,5-HIAA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、二羟基苯乙酸(dihydroxv-phenylaceticacid,DOPAC)的含量。以上标准物均购自Sigma公司。色谱条件:色谱柱为4mm×150mm,Nova-pakCl8,粒径5μm(大连色谱中心填装);流动相为50mM柠檬酸-乙酸钠缓冲液pH3.5,内含1.0mMB-8离子对试剂(八烷基磺酸钠),1.8mM二正丁胺,0.3mMNa2EDTA,4%甲醇,流速1.0mL/min,玻碳电极,检测池电压为+0.75V,柱温18-22℃,3,4-二羟苄胺(DHBA)为内标物。样品