冠突散囊菌发酵制备及其纤维素酶活性测定.docxVIP

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冠突散囊菌发酵制备及其纤维素酶活性测定 微生物纤维素酶的存在于体内,具有独特的优势,能够整合和分解天然纤维。广泛应用于工业、农业、医学和食品领域。 纤维素酶在茯砖茶制造中发挥了很大作用。茯砖茶是紧压黑茶的一种,多以黑毛茶或粗老绿茶为原料,经汽蒸、渥堆、压制、发花和干燥等工序加工而成。茯砖茶加工中的“发花”过程是形成茯砖茶独特品质的关键工艺,“发花”的实质是通过控制一定的外界条件,促使微生物优势菌——冠突散囊菌(Eurotium cristatum)的生长繁殖,产生金黄色的闭囊壳,俗称“金花”,边区消费者历来根据“金花”的质量和数量来判断茯砖茶品质的优劣,把它作为品质特征的标志。茯砖茶加工过程中,有益优势菌──冠突散囊菌大量生长繁殖,并借助其体内的物质代谢与分泌的胞外酶(如多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等)的作用,实现色、香、味品质成分的转化,形成茯砖茶特有的品质风味。“金花”菌分泌的纤维素酶使粗纤维发生降解形成可溶性糖。王增盛等研究表明:在茯砖茶加工中,粗纤维含量降低了4.2%。纤维素酶是纤维素水解的催化剂,适宜的温度和p H值都会提高酶的催化效率,即提高酶促反应速度。在酶的最适温度范围内,温度每升高10℃,酶促反应可相应提高1~2倍。而p H值通过引起底物分子和酶分子的带电状态从而影响酶活力,进而影响酶促反应的速度,适宜的p H值能大大提高酶活力。微生物的正常生长不仅需要大量元素,如磷、硫、钾、钠、钙、镁等,而且也对其他一些微量元素如铁、钴、铝、铜等有一定需求。如果缺乏这些元素,将会导致微生物生理活性降低,甚至停止生长。 通过查阅相关资料,发现对茯砖茶中特有的“金花”菌的纤维素酶的酶学性质研究还很少,而茯砖茶中相关纤维素酶的特性研究对其产品品质的提高显得非常重要。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 检测菌 茯砖茶由湖南省怡清源茶叶有限公司提供;从茯砖茶中分离纯化的“金花”菌──冠突散囊菌。 1.1.2 不同培养条件对czg/黑茶汁的制备茶 (1)分离培养基:改良孟加拉红培养基:葡萄糖12.5 g,蛋白胨6.25 g,KH2PO41.25 g,Mg SO4·7H2O 0.625 g,孟加拉红水溶液12.5 mL(1/300),琼脂18 g,1000 mL黑茶汤(茶汤煮制方法:10 g黑茶加1000 mL水煮沸后保持沸腾30 min,过滤),自然pH,0.1 MPa灭菌30 min后加入0.003 g的链霉素溶液。 (2)CZG茶汤培养基:Mg SO4·7H2O0.5 g,NH4NO33.0 g,K2HPO41.0 g,琼脂20.0 g,CMC-Na 15.0 g,1000 mL黑茶汤(茶汤煮制方法:20 g黑茶加1000 mL水煮沸后保持沸腾30 min,过滤),自然pH,0.1MPa灭菌30 min。 (3)菌种活化培养基(改良马铃薯蔗糖琼脂斜面培养基):马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂20 g,将上述成分添加到1000 mL黑茶汁[茶汤的煮制方法同(1)]中,自然pH,0.1 MPa灭菌30 min。 (4)菌种扩大培养培养基:按照黑茶浸提汁[茶汤的煮制方法同(1)]∶马铃薯蔗糖液体培养基=1∶1的比例制成混合液体培养基,过滤,0.1 MPa灭菌30 min。即为菌种扩大培养培养基。 1.2 试验中的菌株分离、激活和扩展 1.2.1 分离纯度 采用稀释平板涂布法进行砖茶中“金花”菌的分离与纯化。对其进行个体形态和菌落特征观察并斜面保存备用。 1.2.2 菌落周围透明圈的测定 采用平板透明圈法,其原理是刚果红与CMC-Na结合生成络合物,菌落若产生纤维素酶将CMC-Na分解则在菌落周围产生清晰的透明圈。将活化好的菌种用点接法接种到装有CZG茶汤培养基的平皿上于28℃恒温霉菌培养箱中培养4 d。将10 mL 1 mg/m L的刚果红染色液均匀倒入平皿,染色30 min后用1 mol/L的NaCl溶液脱色30 min后测量透明圈的直径。根据有无透明圈或透明圈直径大小判断纤维素酶的产生。 1.2.3 菌种培养及酶活力测定 将保存于斜面的菌种进行活化,制成菌悬液接于菌种扩大培养基中进行摇床发酵培养。28℃,180 r/min,培养5 d。由于纤维素酶属于胞外酶,发酵液于4000 r/min离心15 min,除去菌体及培养基残渣,上清液即为粗酶液。 菌种传代培养及酶活力测定:将“金花”菌进行3次试管斜面传代培养,每次都同时进行培菌产酶。收集3代适量培养样品分别用p H4.8柠檬酸钠缓冲液及p H6.0磷酸缓冲液处理,并用3,5-二硝基水杨酸还原糖法测定纤维素酶活力,确定对应缓冲液类型以及验证该菌所产纤维素酶活力是否具有稳定性。 1.3 纤维素酶活性的测定 参照国家标准测定方法测定。 1.4 酶的最适反应ph值、

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