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植物总RNA的提取及RT-PCR 生物学实验技术 植物总RNA的提取及RT-PCR 一、实验目的 1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法 2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法 二、实验原理 1. RNA提取的原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 2. RT-PCR的原理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。 三、仪器、药品与试剂配方 (一) 仪器及器皿 1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅； 4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次性手套等； 7. 离心管； 8. 培养皿； 9. 烧杯及试剂瓶等。 (二) 药品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 异硫氰酸胍 (GT) 3. 醋酸钠(NaAc) 4. 苯酚 5. 异丙醇 6. 氯仿 7. 乙醇 8. β－巯基乙醇 9. 琼脂糖 10. MLV反转录试剂盒 11. Taq DNA聚合酶 12. 引物 (三) 试剂配制 1． 0.1% DEPC水 灭菌 2. 4 mol/L异硫氰酸胍 3. 2 mol/L NaAc （pH 4.8） 灭菌 4. 3 mol/L NaAc （pH 4.8） 灭菌 5. 4 mol/L LiCl 灭菌 6. 1×TE缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM EDTA（pH8.0）, 灭菌。 四、实验步骤 （一） 总RNA的提取 （1） 研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2 g植物材料，充分研磨后转入一个含有300 l的4M GT的1.5 ml的聚丙烯管中，摇匀。 （2） 加入30 l 2 M NaAc（pH4.9-5.2）摇匀，加入300 l酸酚（水饱和酚pH5.0）， 生物学实验技术 摇匀，加入100 l三氯甲烷，摇匀。 （3） 120XX年 rpm 4℃离心20 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。 （4） 120XX年 rpm 4℃离心10 min，将沉淀悬浮于含100 l 4M氯化锂的1.5 ml EP管 中，于-20℃放置1小时或更长时间。 （5） 120XX年 rpm 4℃离心10-15 min，将沉淀溶于0.4 ml DEPC水中，加入1/2体积 氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，120XX年 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，120XX年 rpm 4℃离心5 min。 （6） 上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或 更长时间。 （7） 120XX年 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10 l b灭菌的DEPC水中。 （8） RNA贮于-80℃。 （二）RNA反转录产生cDNA 在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入： 模板RNA Olig(dT)18 DEPC 水 2 l 1 l 2 l 混匀，70℃水浴中放置2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入： RNasin M－MLV 5×buffer 10 mM dNTP 0.5 l 1 l 2 l 1.5 l 42℃，水浴中反应90 min。72℃，10 min，终止反应。 加入15 l的DEPC灭菌水，使总体积达到25 l。 (三) PCR 1. 在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系 10 X buffer 2.5 l dNTP (2.5 mmol) 2 l RT-PCR产物 5 l Taq酶 0.5 l