第三章分子杂交与印迹技术详解演示文稿.pptVIP

四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 本文档共60页；当前第31页；编辑于星期三\9点58分 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交 印迹杂交 原位杂交 液相杂交 按照杂交分子特性分 DNA-DNA杂交 DNA-RNA杂交 蛋白质杂交 第二节 核酸分子杂交的方法 本文档共60页；当前第32页；编辑于星期三\9点58分 一、Southern印迹杂交 此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。 本文档共60页；当前第33页；编辑于星期三\9点58分 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 本文档共60页；当前第34页；编辑于星期三\9点58分 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 本文档共60页；当前第35页；编辑于星期三\9点58分 （二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记 本文档共60页；当前第36页；编辑于星期三\9点58分 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 本文档共60页；当前第37页；编辑于星期三\9点58分 （四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程 本文档共60页；当前第38页；编辑于星期三\9点58分 1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ?非特异吸附少 本文档共60页；当前第39页；编辑于星期三\9点58分 （2）常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低 本文档共60页；当前第40页；编辑于星期三\9点58分 2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 本文档共60页；当前第41页；编辑于星期三\9点58分 。 本文档共60页；当前第42页；编辑于星期三\9点58分 * 第三章分子杂交与印迹技术详解演示文稿 本文档共60页；当前第1页；编辑于星期三\9点58分 优选第三章分子杂交与印迹技术 本文档共60页；当前第2页；编辑于星期三\9点58分 2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使