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3-氨基-2-恶唑烷酮人工抗原的制备及酶联免疫研究 硝基溶胶药物主要指硝基溶胶酮、偶氮胺、偶氮胺和硝基溶胶酮等含有硝基的合成抗菌药物。硝基溶胶具有良好的抗菌效果，对大多数阳性菌、红景天、某些细菌和原生动物均有杀菌作用，耐药性好，价格低廉。它被广泛用于治疗和预防由艾滋病毒和沙鸡菌引起的哺乳动物胃肠道疾病，并用作饲料添加剂来预防家禽肠道感染。 然而, 近年来越来越多的研究表明, 硝基杂环类化合物具有细胞诱变性、动物致癌毒[8,9,10,11,12,13,14]。科学家已经证实, 硝基呋喃及其代谢物具有诱导基因突变的慢性毒性, 可引起实验动物的发生癌变和基因突变。出于安全性考虑, 美国、欧盟等国家和地区要求该类药物不得用于畜牧养殖中。欧盟对该类药物不得检出。我国农业部2002文件也要求在动物源食品中不得检出硝基呋喃类药物。作者通过考察硝基呋喃类药物的母核结构, 以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料, 合成了完全抗原, 并采用呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮 (AOZ) 的特异性抗体对抗原的性能进行了鉴定。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 牛血清蛋白 (BSA) , 卵清蛋白 (OVA) :上海伯奥生物科技有限公司产品;N, N-二环己基碳二亚胺 (DCC) 和N-羟基丁二酰亚胺 (NHS) :百灵威化学技术有限公司产品;乙醇肼和1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺 (EDC) :上海晶纯试剂有限公司产品;碳酸二甲酯, 甲醇钠和对醛基苯甲酸:上海达瑞精细化学品有限公司产品;其他试剂包括磷酸氢二钠 (AR) , 磷酸二氢钠 (AR) , N, N-二甲基甲酰胺DMF (AR) 等:国药集团化学试剂有限公司产品;呋喃唑酮多克隆抗体:作者所在实验室自制。 1.2 实验设备及设备 酸度计:购自梅特勒-托得多 (上海) 仪器公司产品;纯水仪:美国mini-Q公司产品;UV-2802PC可见光度计:尤尼柯 (上海) 仪器有限公司产品;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司产品;RE-52AA旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂产品;90-2型定时恒温磁力搅拌器和WH-2微型旋涡混合仪:上海沪西分析仪器厂产品;LCQDECA型高效液相色谱-质谱联用仪:美国非尼根公司 (Finnigan company) 产品;DF-1型集热式磁力搅拌水浴锅:金坛荣华仪器有限公司产品;Mu Ltiskan Mks酶标仪和可调试移液器:美国热电公司 (Thermo Lab systems) 产品;ZD-9556水平摇床:太仓科教器材厂产品;Costar96孔8×12可拆酶标板:上海吉泰生物科技有限公司产品。 1.3 半抗原合成 1.3.1 碳酸钙二甲酯法 以碳酸二甲酯和乙醇肼为原料, 合成AOZ。在有蒸馏装置的圆底烧瓶中加入甲醇3.78 m L, 甲醇钠 (30%) 5.82m L, 乙醇肼6.00 m L充分搅拌20 min, 加入碳酸二甲酯1.155 m L。60℃保温1 h, 缓慢搅拌升温至75℃。缓慢蒸出甲醇, 当甲醇蒸馏完毕, 结束反应, 得到AOZ成液。冷却至室温, 加入无水乙醇41 m L, 于4℃冰箱静置, 得到白色固体, 离心后加无水乙醇重结晶3次得到AOZ。反应过程见图1。 1.3.2 dmf的合成 取对醛基苯甲酸0.65 g, 加入纯水10 m L, 再加入3m L 1 mol/L HCl;磁力搅拌下, 在体系中缓慢滴加DMF, 直至对醛基苯甲酸完全溶解, 测定p H约为4.0左右;磁力搅拌下, 加入1.3 g AOZ, 溶解后, 60℃下回流反应过夜, 产生白色固体;将产物离心, 弃上清液, 将白色固体置于滤纸 (放在漏斗中) 上, 用纯水洗涤3次, 氮气吹干, 得到半抗原CPAOZ, 合成路线见图2。 1.4 偶联物质量浓度的测定 按照文献[19-20]方法, 分别采用碳二亚胺法 (EDC活化) 、二环己基碳二亚胺 (DCC活化法) 以及混合酸酐法 (MA) 将CPAOZ分别与载体蛋白BSA, OVA偶联, 制备完全抗原。采用紫外扫描仪对完全抗原进行鉴定。采用Bradford法和Lowry法对偶联物进行偶联物蛋白质质量浓度的测定。用紫外扫描仪, 得到CPAOZ的最大吸收波长, 在CPAOZ的最大吸收波长下分别测已知质量浓度的偶联物和载体蛋白质的吸光值, 并将CPAOZ、完全抗原、载体蛋白的质量浓度根据其相对分子质量转换为摩尔浓度, 根据式 (1) 计算各自的摩尔消光系数: 其中, A为吸光度, c为摩尔浓度。 根据摩尔消光系数计算完全抗原中半抗原和载体蛋白的偶联比, 见式2: 1.5 最佳稀释比例的确定 将上述3种方法制备的完全抗原做为包被抗原, 采用ELISA方法进行验证。通过系列稀释抗原和抗体