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elisa法测定水产品中呋喃唑酮代谢物残留量 硝基溶胶药物是合成的光谱抗生素，是对动物饲料中残留药物的重要监测项目。由于硝基呋喃类药物在体内代谢速度很快, 而在组织中结合的代谢产物则能存留很长一段时间, 所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物。呋喃唑酮的代谢物为3-氨基-2-唑烷酮 (AOZ) 。目前关于AOZ的检测常用LC/UV分析和LC/MS/MS确证法, 由于两法所需仪器昂贵, 实验过程繁琐, 对于一般实验室来说, 开展该项目的检测具有一定的难度。酶联免疫分析法测定水产品中的AOZ, 具有很高的特异性和灵敏度, 操作简单快速、容量大, 能极大地提高分析效率, 降低检测成本, 值得推广普及。 1 材料和方法 1.1 加样器、仪器 微孔板酶标仪 (450 nm) , 均质器, 离心机, 氮吹仪, 振荡器, 微量加样器 (100 μL, 1 000 μL) , 微量8通道加样器 (50～300 μL) 。 1.2 elisa试验 本方法所用试剂均为分析纯, 试验用水为去离子水。Ridascreen? Nitrofuran (AOZ) ELISA试剂盒;0.01 mol/L的2-硝基苯甲醛, 溶剂为二甲亚砜 (每次临用前配, 注意避光) ;AOZ标准溶液, 100 μg/L。 1.3 基苯甲醛的制备 用均质器均质约100 g样品, 称取1 g (精确至0.01 g) 均质过的样品于试管中, 加入4.5 mL 0.1 mol/L盐酸和100 μL 0.01 mol/L的2-硝基苯甲醛, 充分振荡, 在37℃避光过夜酸水解和衍生化 (约16 h) ;取出放置至室温, 加入0.5 mL 0.3 mol/L磷酸钠, 用1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠调pH值至7.0左右, 再加入5mL乙酸乙酯, 激烈振荡10 min;在室温下 3 000 g离心10 min, 从样品管中取出2.5 mL乙酸乙酯层 (相当于0.5 g样品) 到试管中, 于氮吹仪38℃吹干;用正己烷充分溶解干燥的样品残留物, 1 mL的样品缓冲液充分混合, 室温下3 000 g 离心10 min, 取50 μL下层水相进行分析。 1.4 乙酸乙酯的提取 在空白管中加入40.5 μL 100 μg/L的AOZ标准溶液, 代替样品按1.3方法水解和衍生化、萃取, 但上层乙酸乙酯全部转移至另一试管中, 然后于标准衍生管中再加入5 mL的乙酸乙酯, 重复提取共两次。把上层的乙酸乙酯全部取出合并到第一次移出的乙酸乙酯管中, 用氮吹仪于38℃吹干。在标准衍生管中加入1 mL的样品缓冲液充分混合, 则衍生后的呋喃唑酮代谢物标准溶液浓度为4.05 μg/L。 1.5 抗体的争结合 竞争性酶联免疫吸附分析程序按文献及试剂盒说明书。样品中结合的AOZ经水解、衍生化, 与酶标记的衍生物竞争结合有限抗体, 同时此抗体与包被在微孔板上的抗体结合;没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去;加入酶基质/发色剂并且孵育;结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物;加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色;在450 nm处测量吸光度值 (选择参比波长≥600 nm) 。吸光度值与样品中的AOZ浓度成反比。 1.6 酶联免疫分析 将衍生后的AOZ标准溶液用样品缓冲液进行稀释, 浓度系列为:0, 0.05, 0.15, 0.45, 1.35和4.05 μg/L, 代替试剂盒提供的AOZ标准溶液, 与样品一起进行酶联免疫分析。以零浓度标准对应的吸光度值A450 nm为100, 计算其他各浓度的相对A450 nm值 (即相对结合率B/B0) 。以系列标准浓度为横坐标, 相对结合率的百分数为纵坐标绘制半对数标准曲线, 校准曲线在0.05～4.05 μg/L范围内应为线性。每一个样品提取液的浓度 (μg/kg) 可以从校准曲线上读出, 为了获得样品中呋喃唑酮代谢物的实际浓度 (μg/kg) , 从校准曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的前处理稀释系数 (本法稀释系数为2) 。 2 结果与分析 2.1 加标回收率和精密度试验 以美国FDA规定的水产品中AOZ的最大残留限量 (MRL) 1.0 μg/kg和欧盟的MRL 0.5 μg/ kg作为参考, 在不同时间内对样品添加AOZ 0.5 μg/kg和1.0 μg/kg两个水平进行加标回收率和精密度试验。平均回收率分别为99.0%和88.2%,RSD为9.18%～17.8%, 结果见表1。本方法的回收率和精密度试验结果均达到残留监控质量分析的要求。 本法采用标准品与样品同时衍生化的方法, 较试剂盒提供的方法可以显著提高回收率, 有效降低假阴性结果的出现, 提高了检测的准确度。 2.2 检测下限和测限 根据试剂空白AOZ的浓度, 以其3倍标准差和10倍标