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液相色谱-串联质谱法测定布南色林及其代谢物n-去乙基物 布南香林[b]-2-（1-pipalea珠盐）-4-（4-fluoropiel）-5、6、7、8、9、10-hexaeconomica[b]-pylimate]是日本迪友制药有限公司开发的一种新型抗癫痫药物，对氨基乙二醇和五羟胺5-ht2a的受体有很强的抑制作用。研究表明,布南色林对于改善精神分裂症的阳性与阴性症状疗效良好,而且没有发现抗精神病药物常见的锥体外系症状不良反应,有望成为治疗精神分裂症的一线药物。对于人血浆中布南色林及其代谢物的测定方法,国内未见报道。国外报道均采用LC-MS/MS,很多采用固相萃取法进行浓缩检测,操作繁琐,且实验成本较高。本试验拟采用液-液萃取法建立一种简单快速的测定人血浆中布南色林与其代谢物N-去乙基物的LC-MS/MS,并将其应用于布南色林I期临床试验的药动学研究。 1 色谱-质谱条件 布南色林对照品(含量100%,批号丽珠集团丽珠医药研究所),内标物布南色林B(含量100%,批号丽珠集团丽珠医药研究所)。布南色林代谢物N-去乙基物[2-(1-piperazinyl)-4-(4-fluorophenyl)-5,6,7,8,9,10-hexahydrocycloocta[b]-pyridine)]对照品(含量100%,批号丽珠集团丽珠医药研究所),内标物布南色林D(含量100%,批号丽珠集团丽珠医药研究所)。乙腈为色谱纯;甲酸铵为质谱纯;甲酸、醋酸乙酯和二氯甲烷均为色谱级;碳酸氢钠为分析纯;水为重蒸去离子水。 Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent),包括G1379B自动脱气机,G1310A自动调配四元泵,G1329A 自动进样器,G1316A 可调柱温箱;Agilent 6410三重四级杆串联质谱仪;XW-80A 型旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);BP110S 型电子分析天平(德国 Sartorius);MIKRO12-24 型高速离心机(德国 Hettich公司);111 型真空干燥箱(德国 MMM-GROUP公司)。 2 方法和结果 2.1 仪器和质谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse plus C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm);流动相为乙腈-水(87∶13,V/V,含0.005 mol·L-1甲酸铵和0.1%甲酸);流速为0.5 mL·min-1;柱温为40 ℃;进样量为4 μL。 质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子化,毛细管电压4 000 V,喷雾气压力344.75 kPa,干燥气体流速10 L·min-1,干燥气体温度350 ℃。扫描方式为选择性离子监测(SRM),布南色林m/z368.2→297.2,碰撞能量27单位,裂解电压145 V,四级杆捕捉时间0.2 s;布南色林Bm/z396.3→297.2,碰撞能量28单位,裂解电压145 V,四级杆捕捉时间0.2 s;N-去乙基物m/z340.2→297.1,碰撞能量30单位,裂解电压145 V,四级杆捕捉时间0.2 s;布南色林Dm/z356.2→313.3,碰撞能量30单位,裂解电压145 V,四级杆捕捉时间0.2 s。电子倍增器400 V。布南色林、内标布南色林B、布南色林C和内标布南色林D分子裂解图见图1。 2.2 有机层的提取 取含药血浆0.5 mL置10 mL的具塞磨口锥形玻璃离心管中,加入10 000 ng·L-1的内标流动相溶液50 μL,快速振荡3 s,加饱和碳酸氢钠水溶液0.2 mL,快速振荡15 s,再加醋酸乙酯-二氯甲烷4∶1混合提取剂3 mL密塞,旋涡振荡1 min,3 000 r·min-1,离心10 min,吸取有机层2.8 mL置3 mL的带塞磨口锥形玻璃离心管内,42 ℃真空干燥至干。进样前加入流动相混合溶液200 μL,快速振荡5 s使残渣溶解,3 500 r·min-1,离心10 min,吸取上清液4 μL进样。 2.3 方法论的特殊性 2.3.1 空白血浆样品的制备 分别取6名受试者的空白血浆0.5 mL置10 mL的具塞锥形玻璃离心管中,除不加内标外,按“2.2”项下依法操作,进样4 μL,获得空白血浆样品的色谱图,见图2A;将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血浆中,依同法操作获得相应的色谱图,见图2B,布南色林、布南色林B的出峰时间约为4.2和4.6 min;取健康受试者给药后收集的血浆样品,依同法操作,得色谱图2C。结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰布南色林及布南色林B的测定。 2.3.2 空白血浆样品的制备 分别取6名受试者的空白血浆0.5 mL置10 mL的具塞锥形玻璃离心管中,除