半微量凯氏定氮法测定豆粕粗蛋白的影响因素分析.docxVIP

半微量凯氏定氮法测定豆粕粗蛋白的影响因素分析 随着分析手段的逐步演变，蛋白质含量的测定方向正确、快速的方向发展。根据蛋白质的性质, 测定方法分为两大类:一类是利用蛋白质的共性, 如含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量, 通常采用经典的凯氏定氮法, 现在已有采用红外连续消化、自动蒸馏和自动滴定装置的自动凯氏定氮仪;另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性基团、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量, 有双缩脲法、近红外透射光谱法、高效液相色谱法及毛细管电泳分析法等。目前, 测定饲料豆粕中粗蛋白含量大多按照GB6432—86, 使用半微量凯氏定氮法进行。笔者在对豆粕进行测定的过程中发现, 尽管半微量凯氏定氮法步骤简单, 容易操作, 精确度较高, 使用广泛, 但在实际操作中仍然存在很多因素影响测定结果, 从而产生误差。试验对影响半微量凯氏定氮法测定豆粕粗蛋白结果的因素进行了综合分析, 现报道如下。 1 材料和方法 1.1 样品 豆粕, 泰州义丰饲料有限公司提供。 1.2 试剂、标准曲线 电子天平, 精确度为0.000 1 g;KDN-04型消煮炉、消煮管, 购自上海市新嘉电子有限公司;酸式滴定管, 10 mL;微量滴定管, 2 mL;锥形瓶, 100 mL;标准盐酸, 0.02 mol/L盐酸标准溶液;10 g/L硼酸溶液、400 g/L氢氧化钠溶液、浓硫酸、混合催化剂 (硫酸钾、五水硫酸铜) 、硫酸铵 (AR, 纯度≥99.5%) 。以上试剂均为分析纯, 溶液均用不含氨的纯化水配制。以上仪器和用品均由江苏畜牧兽医职业技术学院饲料分析检测实验室提供。 1.3 取样规范中常用的取样说明 在测定粗蛋白含量时, 豆粕要全部通过40目筛, 粉碎必须完全 (应注意取样的代表性) 。如果被测豆粕样品只取部分进行粉碎, 检测结果将出现偏差, 试验分别选取完全粉碎 (粉碎率为64.00%) 和部分粉碎 (粉碎率为34.90%) 豆粕进行测定。 1.4 加热、澄清试验 将试样加入催化剂后, 再加12 mL浓硫酸, 然后放在消化炉上缓缓加热, 待泡沫消失后逐步加大火力, 当溶液沸腾至澄清的绿色后开始计时, 根据试验要求分别加热, 每个时间段各做7个样;同时, 分别做空白对照样品1个 (当粗蛋白质含量在25%以上时允许相对偏差为1%) 。 1.5 粉碎液的平衡和处理 将消化后的分解液完全转移至100 mL 容量瓶中, 分别做充分摇匀和不摇匀处理。 1.6 蒸馏或蒸馏 蒸馏时加入试样分解液和40%氢氧化钠后, 自接收液的颜色完全变为蓝绿色后, 蒸馏4 min, 然后使冷凝管离开液面再蒸馏1 min即可。如果操作者没有实际经验, 担心蒸馏时间不够使氨吸收不完全、产生的结果偏低, 可以用pH试纸来检测流出物, 以证明蒸馏是否完全。蒸馏时间以反应室液体沸腾时计时。 1.7 滴注管的选择 选用普通酸式滴定管和2 mL微量滴定管分别进行滴定, 比较测定结果。 2 结果与分析 2.1 粉碎程度对粗蛋白含量测定结果的影响见表1 由表1可知, 如果被测样品粉碎不完全, 粗蛋白的测定结果将偏低。 2.2 不同消化时间对粗蛋白含量的影响 消化时间对饲料中粗蛋白的测定尤为重要。由表2可知, 不同消化时间所测粗蛋白的结果差异并不明显, 样品消化70分钟时的粗蛋白含量偏低, 随着消化时间的延长粗蛋白含量逐渐增加, 从120分钟开始粗蛋白含量相对稳定。 2.3 采用均匀法测定了粗蛋白含量的结果见表3 由表3可知, 容量瓶充分摇匀后进行滴定的相对误差较小。 2.4 粗蛋白的测定 由表4可见:蒸馏3 min, 粗蛋白含量偏低;蒸馏4～5 min, 粗蛋白含量相对稳定;以后随着蒸馏时间的延长, 粗蛋白含量无明显增加。可见适宜的蒸馏吋间为4～5 min, 过长的蒸馏时间对结果无显著改善, 还会造成时间和资源的浪费。 2.5 滴注管的选择对粗蛋白含量测定结果的影响见表5 由表5可知, 普通酸式滴定管滴定相对误差较大。 3 讨论 3.1 样品分解液的定容后，应进行摇匀处理 在每次蒸馏前一定要将冷却后定容好的分解液充分摇匀, 如果未摇匀测出结果的偏差很大。 3.2 消化时间越短 样品消化时间最好控制在120 min左右。消化时间太短, 饲料中的氮不能充分转化成氨;时间长于135 min, 也会引起测定结果偏低, 会造成时间和资源的浪费。 3.3 u3000滴定 由于普通酸式滴定管管口较大, 滴1滴为 0.05～0.08 mL, 在滴定硼酸吸收液由蓝绿到灰红的终点过程中, 极易滴定过量, 如果过量后继续滴加HCl标准液, 硼酸接收液的颜色变化并不明显。用2瓶同样硼酸接收液作对比, 其中一瓶滴定过量, 结果滴定终点颜色和滴定精确的终点颜色差别不大。由此说明, 在滴定过程中若用普通酸式滴定管滴定很容易造成滴