基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法.pdfVIP

基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法 1 范围 本文件规定了基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性评价的方法原理、受试物、仪器设备、试验 准备、试验步骤、保证试验有效性的条件、判定步骤、数据处理与试验报告等内容。 本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性评价。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 斑马鱼 zebrafish 模式动物的一种，常用于教学和科研。生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤 科、斑马鱼属、斑马鱼种。 3.2 AB系斑马鱼 AB strain zebrafish 实验室常用斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。 3.3 仔鱼 larva 性腺发育尚未成熟的斑马鱼。 3.4 受精后小时数 hours post-fertilization （dpf） 斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。 3.5 眼周水肿 periocular edema 斑马鱼双眼内部由于水分分布失衡，液体局部堆积使眼外围轮廓异常膨大。 3.6 肌酐 creatinine 是肌肉在体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外，血肌酐值可以反映肾小球的滤过功能。。 3.7 尿蛋白 proteinuria 尿液中的蛋白质含量增加而能够被检测到，反映肾脏滤过屏障功能情况。 3.8 10 %致死浓度 10% lethalconcentration （LC ） 10 受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。没有心跳判定为死亡。 3.9 荧光实时定量聚合酶链式反应 Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） 在DNA扩增反应中，应用荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。 4 方法原理 3 斑马鱼胚胎发育周期短，72hpf肾发育完成。在进化水平上，斑马鱼幼鱼的肾为前肾，仅由一 对肾单位组成，但其组织结构、细胞类型及分子种类与哺乳动物的肾相似。受药物或其他肾毒性化 合物影响时，斑马鱼产生与哺乳动物相似的肾功能异常反应，出现水电解质调节失衡、代谢废物排 出受阻及蛋白渗漏现象。同时，斑马鱼肾生理及病理相关的信号通路机制与哺乳动物相似，肾功能 损伤后，肾小球滤过屏障的重要结构蛋白肾病蛋白nephrin、肾小管损伤密切相关的肾损伤分子kim1 的表达水平发生变化，参与介导肾病变发生。因此，通过检测斑马鱼形态、肌酐含量、尿蛋白水平、 nephrin基因表达量和kim1基因表达量等指标，可以评价样品的肾毒性。 5 受试物 5.1 样品配制 5.1.1 水溶性样品：斑马鱼培养水直接溶解配制成检测溶液。 5.1.2 非水溶性样品：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊 液。 5.2 受试物准备量 5.2.1 固态受试物检测用量10 mg～50 mg。 5.2.2 液态受试物检测用量30 mL～50 mL。 5.2.3 半固态受试物检测用量20 mg～100 mg。 5.2.4 半液态受试物检测用量20 mL～100 mL。 5.3 受试物相关信息 5.3.1 受试物的名称、性状、批号、规格、生产日期、保存条件、保质期。 5.3.2 受试物为单体成分时，还需要提供该成分相应的化学信息，包括分子量、分子式、分子结构。 5.3.3 提供受试物理化性质，包含如下信息： a) 在水中或其它溶剂中的溶解性； b) 在水中和光中的稳定性； c) 温度对受试物稳定性的影响。 6 仪器设备 6.1 分析天平。精度0.0001g。 6.2 量筒。500mL，精度0.5mL 6.3 体视显微镜。配带图像采集系统，放大倍数为40倍。 6.4 RT-qPCR反应仪。内置96孔半导体控温PCR模块；温控精度：≤±0.25℃；温控范围：0℃～99.9℃。 6.5 恒温光照培养箱。精度±1℃。 6.6 斑马鱼养殖系统。配备温控装置，水循环和过滤装置。 6.7 水质监测设备。pH计、溶解氧测定仪、盐度计。 6.8 试验容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受试物可能吸附于聚苯乙烯容器时，应选