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牛大力组织培养瓶内复壮瓶外生根快繁技术研究 牛丁是蝴蝶科的一种金属丝。它也被称为甜牛丁、山虎、满转、山莲藕。主要用于肺热、肺虚咳嗽、肺结核、关节炎、腰肌劳动、慢性支气管炎、慢性肝炎、白带等。它是生产各种中药的主要原料。广东人民和越南经常使用块根汤。这是一种经济价值高、应用价值的药物和食品。目前, 组织培养快速繁育已成为牛大力苗木繁育的一条有效途径, 针对组织培养中出现材料褐化, 产生异常愈伤组织、组培苗瓶内生根困难, 瓶外生根技术还没在完整报道, 对此我们将近2年来的研究作如下报道。 1 培训材料 采集广西钦州那雾岭野生牛大力优良单株, 栽种于钦州市林业科学研究所种质资源圃, 从植株上剪下新梢为外植体。 2 壮苗培养基改良ms+kt 初代培养基:MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L, 添加头孢唑林钠10 mg/L。 继代增殖培养基:改良MS+6-BA0.4 mg/L+KT 0.4 mg/L+NAA 0.3 mg/L。 壮苗培养基:改良MS+KT 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L。 改良MS (3/5 NH4NO3、8/5 KH2PO4、6/5铁盐、半胱氨酸5 mg/L、VB28 mg/L) , 以上培养基均加蔗糖3%, 琼脂0.3%, pH值5.6～5.8, 培养温度 (26±1) ℃, 光照时间12 h/d, 光照强度400～2 000 lx。 3 带芽茎段的培养 剪取牛大力半木质化茎条, 去掉叶片, 剪成3～5 cm的长茎段, 用洗洁精及自来水冲洗干净, 在超净工作台上用0.1%的升汞溶液 (加入1滴吐温-80) 灭菌7～10 min后, 用无菌水冲洗5～6次, 剪除两端切口, 剪成1～1.5 cm长的带芽茎段, 接种到初代培养基, 暗培养10～15 d后, 腋芽萌动, 再弱光培养, 25 d腋芽长到1 cm, 转移至强光下进行培养, 40 d腋芽长成1.5～3 cm长的单一芽苗, 无叶片分化。 4 增殖培养筛选 将初代培养长成的芽苗茎剪成1.5～2 cm的长茎段横放接入到继代增殖培养基, 经过25～30 d的培养, 从每个茎段腋芽处萌发5～7个丛生芽, 待小芽长至3～6 cm, 逐渐分化出1～3片复叶。 5 壮苗和光培养 剪取高约4 cm, 有2片复叶的芽苗单株竖放转接到壮苗培养基, 弱光下培养7 d, 转移至强光下培养。复壮培养15～20 d, 复壮苗高4～5 cm, 叶片浓绿, 茎木质化程度高, 生长旺盛。 6 abt生根培养培养 移栽基质按黄心土:河沙:泥炭土 (10:1:1) 的比例拌匀, 用8 cm×12 cm营养袋装好备用。移栽前一天用0.1%高锰酸钾溶液进行消毒, 移栽时用清水把基质淋透。移栽前, 将瓶内复壮苗用清水洗净基部培养基, 再置于500 mg/L ABT生根粉或300mg/L IBA生根剂溶液中浸蘸约1 min, 扦插在营养袋基质中, 立即搭小拱棚覆盖塑料薄膜及黑网, 保持苗床温、湿度, 棚内相对湿度保持在90%以上, 温度控制在30℃以下, 移栽1周后, 可揭开部分薄膜透气, 以后揭开薄膜的面积可逐渐加大, 每间隔7 d喷施1次杀菌剂及叶面肥, 移栽40 d出主根2条, 生根率达75%～85%。90 d后生根苗高达10 cm, 主根1～4条, 多数为2条, 粗度达0.15 cm, 根长最长可达15 cm, 须根10～20条。180 d后, 主根膨大成圆柱状或两个纺锤体连成一串, 膨大处直径达0.8～1.3 cm。 7 瓶外生根技术 (1) 通过优化MS培养基并进行复壮, 能有效防止牛大力组织培养过程中材料褐化及异常愈伤组织产生, 并能促进复叶分化, 增加继代苗高度及茎的木质化程度, 为瓶外生根提供高质量的有效芽苗。 (2) 通过本研究得出, 利用高度约4 cm的芽苗, 用ABT生根粉500 mg/L或IBA300 mg/L生根促进剂处理后进行移植, 生根率最高可达85%。牛大力芽苗瓶外生根效果除了芽苗质量和生根促进剂产生较大影响外, 还与基质、季节及环境因子 (温度、湿度、光照) 有关。在瓶外生根中应结合实际情况进行适度的调控。 (3) 瓶外生根技术是一项在组培工厂化育苗中具有很大发展潜力的实用技术。利用瓶外生根技术对牛大力进行工厂化育苗, 不仅减少了组培生根培养工序, 缩短培育周期, 而且可大幅度降低苗木的培育成本。