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T/CCAA 36-2020X Ⅱ ICS03.120.20 CCS A 00 团体标准 T/CCAA XX—XXXX 水体中杯状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 A method for determination of calicivirus in water real-time RT-PCR （征求意见稿） 202X -XX -XX发布 202X - XX - XX实施 中国认证认可协会 发布 T/CCAA 36-2020X 目 次 TOC \o 1-2 \h \u 目 次 II 前 言 II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 设备和材料要求 4 5 试剂 4 6 操作步骤 4 6.1 病毒提取 5 6.1.1 膜过滤法 5 6.1.2 水体自动采样及微生物富集系统法 5 6.2 病毒RNA提取和纯化 5 6.2.1 病毒裂解 6 6.2.2 病毒RNA提取 6 6.2.3 病毒RNA纯化 6 6.3 质量控制 6 6.3.1 空白对照 6 6.3.2 阴性对照 6 6.3.3 阳性对照 6 6.3.4 过程控制病毒 6 6.3.5 外加扩增控制 7 6.4 实时荧光RT-PCR 7 7 结果与报告 7 7.1 检验有效性判定 7 7.2 结果判定 7 7.3 结果报告 7 8 生物安全措施 8 附录 A 9 附录B 10 附录 C 11 附录 D 13 附录E 1 附录F 3 T/CCAA XX-202X T/CCAA XX-202X Ⅲ PAGE PAGE III 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国认证认可协会提出并归口。 本文件起草单位：北京美正生物科技有限公司、中华人民共和国大连海关、中国合格评定国家认可中心、本溪市动物疫病预防控制中心、拱北海关技术中心、浙江诺威检测认证有限公司、国检测试控股集团辽宁有限公司。 本文件主要起草人：刘磊、徐娜、白庆华、王志强、姚丽锋、周傲白雪、麻丽丹、陶文靖、盛琳、陆嘉诚、崔亚丽、杨希国、李丽、刘石鑫。 水体中杯状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 范围 本文件给出了水体中杯状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法检测要求。 本文件适用于水体中杯状病毒检测，包括水源水、包装饮用水、食品加工用水、水产养殖用水、海水、娱乐用水、医疗机构污水和地下水的定性检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 术语和定义 GB/T 27000界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 杯状病毒 Hepatitis A virus（HAV） 杯状病毒包括诺如病毒（Norovirus,NV）和扎如病毒（sapovirus，SPAV）。 诺如病毒基因组由单股正链RNA分子组成，基因组大小为7 654 bp（不包括3端一条长约110 bp的PolyA尾巴），由3个开放阅读框（open reading frames， ORFs）组成，附着于一个无包膜的蛋白层内，具有明显的杯状切迹。其中ORF1 编码一种大的具有保守序列的多聚酶非结构蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶。ORF2编码一种分子量为58 kD的衣壳蛋白，此蛋白可自聚形成病毒样颗粒。ORF3编码一种分子量为22.5 kD的微小结构蛋白，此蛋白功能尚不清楚。根据诺如病毒的全部衣壳蛋白基因序列，病毒可分为5个基因组，包括GI型、GII型、GIII型、GIV型、GV型。其中感染人的为GI、GII、GIV型，GIII、GV型只感染动物，GII型是引起人类食物感染的主要基因型。 札如病毒直径约为35 nm，无包膜，具有明显的扇形边缘，在毒粒表面有32个杯状凹陷，这使其鉴别变得容易和清晰。札如病毒为线性的单股正链RNA病毒，基因组大小约7 kb～8 kb，带有PolyA尾，包括3个开放阅读框（ORFs）。根据RNA聚合酶区和衣壳蛋白区的基因多样性，可以进一步分为5个遗传组（GI到GV），其中GI型、GII型、GIV型、