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T/CCAA 36-2020X Ⅱ ICS03.120.20 CCS A 00 团体标准 T/CCAA XX—XXXX 水体中甲型肝炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 A method for determination of hepatitis A virus in water real-time RT-PCR （征求意见稿） 202X -XX -XX发布 202X - XX - XX实施 中国认证认可协会 发布 T/CCAA 36-2020X 目 次 TOC \o 1-2 \h \u 目 次 II 前 言 II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 设备和材料要求 3 5 试剂 4 6 操作步骤 4 6.1 病毒提取 4 6.1.1 膜过滤法 4 6.1.2 水体自动采样及微生物富集系统法 5 6.2 病毒RNA提取和纯化 5 6.2.1 病毒裂解 5 6.2.2 病毒RNA提取 5 6.2.3 病毒RNA纯化 6 6.3 质量控制 6 6.3.1 空白对照 6 6.3.2 阴性对照 6 6.3.3 阳性对照 6 6.3.4 过程控制病毒 6 6.3.5 外加扩增控制 6 6.4 实时荧光RT-PCR 7 7 结果与报告 7 7.1 检验有效性判定 7 7.2 结果判定 7 7.3 结果报告 7 8 生物安全措施 7 附录 A 8 附录B 9 附录 C 10 附 录 D 12 附录E 1 附录F 3 T/CCAA XX-202X T/CCAA XX-202X Ⅲ PAGE PAGE III 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国认证认可协会提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国丹东海关、庄河市检验检测认证技术服务中心、中国合格评定国家认可中心、本溪市动物疫病预防控制中心、拱北海关技术中心、北京美正生物科技有限公司、浙江诺威检测认证有限公司、国检测试控股集团辽宁有限公司。 本文件主要起草人：麻丽丹、朱金艳、白庆华、王志强、姚丽锋、周傲白雪、刘磊、陶文靖、盛琳、陆嘉诚、崔亚丽、杨希国、李丽、刘石鑫。 水体中甲型肝炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 范围 本文件给出了水体中甲型肝炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法检测要求。 本文件适用于水体中甲型肝炎病毒检测，包括水源水、包装饮用水、食品加工用水、水产养殖用水、海水、娱乐用水、医疗机构污水和地下水的定性检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 术语和定义 GB/T 27000界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 甲型肝炎病毒 Hepatitis A virus（HAV） 甲型肝炎病毒，又称甲肝病毒，为 小RNA病毒科嗜肝病毒属，为单股 正链RNA。甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由于感染了甲肝病毒引起的以肝脏炎症病变为主的一种传染病。甲肝病毒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有六个基因型，仅有一个血清型，每一壳微粒由4种不同的多肽即VP1、VP2、VP3和VP4所组成。 3.2 实时荧光RT-PCR real time RT-PCR 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，利用荧光信号的积累实时监控整个RT-PCR扩增过程。 3.3 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 3.4 过程质控物质process control 通过添加与目的病毒类似的外源质控物质如 MS2 噬菌体，来监测整个检测过程，通过对最终过程质控物质回收率的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量。 3.5 外部控制 RNA external control RNA (EC RNA) 外源阳性对照 RNA，作为RT- PCR 过程的阳性对照。 设备和材料要求 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其