团体标准草案-星状病毒.docxVIP

T/CCAA 36-2020X Ⅱ ICS03.120.20 CCS A 00 团体标准 T/CCAA XX—XXXX 水体中星状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 A method for determination of astrovirus in water real-time RT-PCR （征求意见稿） 202X -XX -XX发布 202X - XX - XX实施 中国认证认可协会 发布 T/CCAA 36-2020X 目 次 TOC \o 1-2 \h \u 目 次 II 前 言 II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 术语和定义 3 4 设备和材料要求 4 5 试剂 4 6 操作步骤 4 6.1 病毒提取 5 6.1.1 膜过滤法 5 6.1.2 水体自动采样及微生物富集系统法 5 6.2 病毒RNA提取和纯化 5 6.2.1 病毒裂解 6 6.2.2 病毒RNA提取 6 6.2.3 病毒RNA纯化 6 6.3 质量控制 6 6.3.1 空白对照 6 6.3.2 阴性对照 6 6.3.3 阳性对照 6 6.3.4 过程控制病毒 6 6.3.5 外加扩增控制 7 6.4 实时荧光RT-PCR 7 7 结果与报告 7 7.1 检验有效性判定 7 7.2 结果判定 7 7.3 结果报告 7 8 生物安全措施 8 附录 A 9 附录B 10 附录 C 11 附录 D 13 附录E 1 附录F 3 T/CCAA XX-202X T/CCAA XX-202X Ⅲ PAGE PAGE III 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国认证认可协会提出并归口。 本文件起草单位：上海市徐汇区疾病预防控制中心、中华人民共和国丹东海关、拱北海关技术中心、广州海关技术中心、庄河市检验检测认证技术服务中心、北京美正生物科技有限公司、上海安合环境检测技术有限公司、国检测试控股集团辽宁有限公司。 本文件主要起草人：刘志勇、麻丽丹、姚丽锋、周傲白雪、丁宁、朱金艳、刘磊、陶文靖、陆嘉诚、盛琳、杨军、杨希国、李丽、刘石鑫。 水体中星状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 范围 本文件给出了水体中星状病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法检测要求。 本文件适用于水体中星状病毒检测，包括水源水、包装饮用水、食品加工用水、水产养殖用水、海水、娱乐用水、医疗机构污水和地下水的定性检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 术语和定义 GB/T 27000界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 星状病毒 Hepatitis A virus（HAV） 人星状病毒为无包膜单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈二十面体对称，直径28 nm～30 nm，在电镜下可见约10 % 的病毒粒子表面呈特征性五角或六角星状结构。星状病毒基因组合长618 kb，有三个开放阅读框架（ORFs）ORF1a、ORF1b、和ORF2。ORF1a和ORF1b为高度保守区，为编码蛋白酶和RNA 多聚酶，ORF2为编码结构蛋白（衣壳蛋白）。在星状病毒感染的细胞中还能检测到一个217 kb的亚基因组RNA1，它仅有基因组3’侧的1/3，包含ORF2，由于星状病毒的基因组结构与其他小圆结构状病毒（SRSV） 不同，因此有最初划归SRSV而成为一个独立的病毒家族。此外星状病毒还包括一个5’非编码区。一个3’非编码区，和一个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。5’端为保守区域,而3’端为多变区，但同一血清型毒株其N端和C端一般高度同源或相同。根据ORF2衣壳蛋白的结构差异，将星状病毒分为HAstVs-1至HAstVs-8等8个血清型。 3.2 实时荧光RT-PCR real time RT-PCR 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，利用荧光信号的积累实时监控整个RT-PCR扩增过程。 3.3 Ct值 cycle threshold 每个