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免疫组织化学二步法实验步骤
1、脱蜡至水
、将组织切片置于玻片架上，用电吹风吹烤，使石蜡完全熔融为止；
、将吹烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；
、从二甲苯中取出切片置入无水乙醇中，浸泡3～5min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3～5min；再依次置入90％、80％、70％酒精中梯度水化，各浸泡3～5min。
2、抗原修复（CBS PH6.0）
、用蒸馏水润洗切片表面的酒精2～3次，尽量不残留酒精；
、将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的CBS缓冲液中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min；
、取出修复盒，使其自然冷却至室温。
3、滴加过氧化氢
、用PH7.2～7.4的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3～5min；
、将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；
2 2、将切片置于湿盒上，滴加1～2滴3％HO溶液，室温孵育10～15min
2 2
4、滴加一抗
、将切片置于玻片架上，用PH7.2～7.4的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3～5min；
、将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；
、将切片置于湿盒上，滴加一抗50～60ul,37℃孵育60min。
5、滴加二抗
、将切片置于玻片架上，用PH7.2～7.4的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3～5min；
、将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；
、将切片置于湿盒上，滴加二抗50～60ul,室温孵育30min。
6、DAB显色
、将切片置于玻片架上，用PH7.2～7.4的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3～5min；
、配制DAB显色液：a液：b液：c液：蒸馏水体积比按照1：1：1：20比例配制；
、将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上的PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液；
、将切片置于白纸上，滴加DAB50～60ul，室温下镜检显色。
7、苏木素复染
、将切片置于玻片架上，用自来水润洗切片表面的DAB溶液2～3次；
、将切片置入苏木素染色缸中浸泡3min，取出，自来水洗去表面残留的苏木素；
、将切片浸入1％盐酸酒精中分化，迅速取出，置入自来水中润洗2～3次，弃去洗液，自来水流水冲洗组织10min（返蓝）。
8、脱水封片
、将切片置入90％酒精中浸泡5min，取出；置入无水乙醇中，浸泡5min，取出；置入第二缸无水乙醇中，浸泡5min，取出；
、用电吹风吹干残留组织表面的酒精，树脂封片。注意事项：
1、水洗过程中水流不可过大，避免掉片；
3、滴加各种试剂之前，务必将组织上的残液甩干，以免试剂被二次稀释。2
3、滴加各种试剂之前，务必将组织上的残液甩干，以免试剂被二次稀释。
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