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蛋白质印迹（Westernblot）样品制备

蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。

目录

裂解缓冲液

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

制备细胞培养物裂解物

制备组织裂解物

测定蛋白质浓度

制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品

裂解缓冲液

不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。

选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂（NP-40、TritonX-100）的裂解缓冲液。

蛋白质位置及相应裂解缓冲液的选择

蛋白质位置 推荐缓冲液

全细胞

NP-40

细胞质（可溶）

Tris-HCl

细胞质（细胞骨架结合）

Tris-Triton

膜结合

NP-40或RIPA

细胞核

RIPA或采用细胞核结构组分实验方案*

线粒体

RIPA或采用线粒体结构组分实验方案*

*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用青参阅我们的亚细胞组分分离实验方案。

裂解缓冲液配方:

NP-40缓冲液

150mM氯化钠

1.0%NP-40（可用TritonX-100替代NP-40）

50mMTris,pH8.0

这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。

RIPA缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）

150mM氯化钠

1.0%NP-40或TritonX-100

0.5%脱氧胆酸钠*

0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）

50mMTris,pH8.0

*可制备成10%的母液，避光保存。

RIPA缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含

NP-40或TritonX-100的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如TritonX-100）。使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用Dounce匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用Tris缓冲液即可，但如前文所述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。

Tris-HCl缓冲液

20mMTris-HCl,pH7.5

Tris-Triton缓冲液（细胞骨架蛋白）

10mMTris,pH7.4

100mMNaCl

1mMEDTA

1mMEGTA

1%TritonX-100

10%甘油

0.1%SDS

0.5%脱氧胆酸盐

以上4种缓冲液可在4°C下保存数周，分装之后可在-20°C下储存长达1年。

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在

4C下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。

许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，但您也可以自行制备抑制剂混合物。

抑制剂 可抑制的蛋白酶/ 在裂解缓冲液中的母液（储存于

最终浓度 -20C）

磷酸酶

抑肽酶

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶

2Rg/mL

用水稀释至10

mg/mL。不得反复使用融化的分装试样。

亮抑酶肽

溶酶体蛋白酶

5-10Rg/mL

用水稀释。不得反复使用融化的分装试样。

胃酶抑素A

天冬氨酸蛋白酶

1Rg/mL

用甲醇稀释至1

mM。

PMSF

丝氨酸、半胱氨酸

蛋白酶

1mM

用乙醇稀释。可反复使用同一分装试样。

EDTA

需要Mg2+和

Mn2+的金属蛋白酶

5mM

用蒸馏水稀释至

0.5M。将pH调节至8.0。

EGTA

需要Ca2+的金属

蛋白酶

1mM

用蒸馏水稀释至

0.5M。将pH调节至8.0。

氟化钠

丝氨酸/苏氨酸磷

酸酶

5-10mM

用水稀释。解冻之

后不得反复使用。

原机酸钠

酪氨酸磷酸酶

1mM

用水稀释。解冻之

后不得反复使用。

制备原帆酸钠

所有步骤均在通风橱中进行。

用双蒸水制备100mM原帆酸钠溶液。

用HCl将pH调节