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食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、 实验目的

学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、 实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。

消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=（NH4）2S04（其中CuSO4做催化剂）

蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3,收集于H3BO3溶液中；

（NHXSO+2NaOH=2NH+2HO+N^SO.

2NH3+4H3BO3=（NH4）.B4O7+5H.O

滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

（NHXBO+2HCl+5HO=2NHCl+4HBO.

三、 仪器与试剂

（一）试剂

硫酸铜（CuSO4?5H2O）（催化剂）

硫酸钾（提高沸点）

浓硫酸（A.R）

硼酸溶液（2%）：称量2g硼酸（H3BO3）粉末溶于蒸馏水100mL，（容量瓶）定容100mL

氢氧化钠溶液（30%）：30克氢氧化钠溶于蒸馏水（容量瓶）定容100mL

0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。

混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%漠甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。

0.1%的甲基红乙醇溶液：0.1g甲基红指示剂溶于100mL60%乙醇中；

0.1%的漠甲酚绿乙醇溶液：0.1g漠甲酚绿指示剂溶于100mL20%乙醇中

四、 实验步骤

1.样品消化

称取面粉1.00g（±0.001g）,用称量纸卷好小心的送入干燥消化管底部，切勿粘在瓶口或瓶颈。向另一消化管中加入1ml蒸馏水做空白试验。在每个消化管中加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，两颗玻璃珠，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，在通风橱中加热消化，接通电源，在加热初始阶段注意防止样品飞溅。消化炉温度起先控制在200°C左右（待内容物全部炭化，泡沫停止后）20min后可以再设定至450C以上。消化终点是以消化液的颜色来判定的，当消化液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，然后结束消化过程。取下放冷，小心加20mL水（注意慢加，边加边摇），放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。

碱化蒸馏

蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH、曰20注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内。按面板上硼酸开关，量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2?3滴，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入消化管，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。再按面板上碱液开关，使10mL30%氢氧化钠溶液倒入消化管，然后按面板上蒸馏开关，就开始蒸馏。从指示剂开始变色时计时，通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。

同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。

样品滴定

以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定由绿变为淡紫色或灰色，即为终点。

五、结果计算

X=（匕-匕）*。x0.0140x「x100

m

x10

式中 X—00样品蛋白质含量（g/100g）；

V1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；

V2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；

c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；

0.0140——1.0mL盐酸［c（HCl）=1.000mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m 样品的质量（g）；

F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；

高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为

6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。

计算结果保留三位有效数字。

六、注意事项及说明

（1）样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

（3）硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入