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含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化

用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因

所需特殊试剂：1MIPTG

将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37°C培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。

分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37C通气培养过夜。

取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20—37C）震荡培养4小时，至对数中期（A550=0.1-1.0）。

对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5,2.5,3.0，3.5,4.0，4.5,5.0mM相同的温度继续通气培养。

在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。

细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。

将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1XSDS蛋白上样缓冲液中，100C加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS—PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。

大量表达靶蛋白

取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的

LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37C通气过夜培养。

2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。

2.

以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。

收集菌液，4°C，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，一70°C保存。

细菌破碎和蛋白质溶解

所需特殊试剂：

非变性裂解液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,10mM咪唑，pH8.0超声破碎液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,pH8.0

每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。

超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟，菌量不超过1g）。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯置于冰浴中。

超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。

将细菌破碎液以10000rpm，30分钟，4C离心，收集上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。

分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于一70C保存。

Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略

（一）若为上清表达

所需特殊试剂：

非变性裂解液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,10mM咪唑，pH8.0Washbuffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,20mM咪唑，pH8.0Elutionbuffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,250mM咪唑，pH8.0

离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。

将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5-6秒/滴），收集流出液体。可以取样进行SDS，看蛋白挂柱情况。

用Washbuffer洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50-100倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。

用Elutionbuffer洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A2800.1。

测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行SDS，分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并a280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋