蛋白质及氨基酸的显色反应.docxVIP

第二讲蛋白质及氨基酸的显色反应

、实验目的:

了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式

了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理

学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法

二、 实验原理

蛋白质分子中因含有某种特殊氨基酸或某种结构，可与多种化合物作用，产生各种颜色反应。这种颜色反应可作为蛋白质的定性和定量实验。

三、 实验仪器、试剂和材料

1、 仪器：试管及试管架、试管夹、水浴锅、电陶炉。

2、 试剂和材料：

蛋白质溶液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20倍，用2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。

尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。

10%NaOH溶液、浓硝酸（比重1.42）、1%硫酸铜溶液、浓硫酸（A?R）、冰醋酸（C?P）、0.5%谷氨酸钠溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%醋酸铅溶液、浓盐酸、红色石蕊试纸。

四、 显色反应

紫色路合物分子结何式1、 双缩脲反应：

紫色路合物分子结何式

原理：如将服素加热，则两分子服素放出一分子氨而形成双缩服。双缩服在碱性环境中硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩服反应。蛋白质分子含有多个肽键与双缩服结构相似，故能呈此反应，形成紫红或蓝紫色的络合物。双缩服反应可用于好、鉴定蛋白质的存在及蛋白质水解是否完全用比色法可作蛋白质的定量测定。

步骤：（1）取少量结晶尿素（火柴头大小）放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩服，释出之氨可用红色石蕊试纸（遇酸变红，遇碱变蓝）试之，至试管内有白色固体出现停止加热（熔解至硬化，刚硬化时即停止加热），冷却。然后加10%氢氧化钠溶液1ml摇匀，再加2滴1%硫酸铜溶液，混匀，观察颜色变化。

（2）另取一试管，加蛋白溶液（含有多个多肽键）约10滴，再加10%氢氧化钠溶液10滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀。观察颜色变化。

2、 薛三酮反应

原理：除脯氨酸、羟脯氨酸外与茚三酮生成黄色物质外，所有a-氨基酸都能和茚三酮反应生成蓝紫色化合物。此反应极为灵敏，其适宜PH为5—7。此反应已广泛应用于氨基酸的定量测定。氨、P-丙氨酸和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸和肽链上的亚氨基呈阴性反应。蛋白质仅呈弱阳性反应。

步骤：（1）取2支试管，分别加入1ml蛋白质溶液及0.5%谷氨酸钠溶液5滴。再向两试管添加0.1%的茚三酮——乙醇溶液2滴，混匀后置沸水浴中加热5-10分钟，观察颜色变化。

（2）在一块小滤纸上滴0.5%甘氨酸溶液1滴，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮——乙醇溶液1滴，用吹风机吹干显色，观察紫红色斑点的出现。

3、 黄色反应

原理：蛋白质分子含有苯核结构的氨基酸（如酪氨酸和色氨酸等），遇浓硝酸可硝化成黄色的硝基苯衍生物，此物质在碱性溶液中转变为桔黄色的硝醍酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此，都有黄色反应。

步骤：取一支小试管，加入蛋白溶液约0.5ml及浓硝酸2滴，由于强酸作用，出现蛋白质沉淀。置沸水浴中加热（不必沸腾），观察沉淀颜色。取出冷却后逐滴加入10%NaOH溶液，当试管中溶液呈碱性时，观察并记录沉淀颜色变化。

4、 乙醛酸反应：

原理：当向蛋白质溶液中加入乙醛酸并用硫酸重叠时，则产生红紫色。显色物质可能是醛与两个分子色氨酸脱水缩合形成靛蓝相似的物质，冰醋酸一般都含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸。

步骤：取一支试管，加入蛋白质溶液0.5ml，再加入冰醋酸约1ml，摇匀，倾斜试管，谨慎地沿管壁加入浓硫酸（A?R）约1ml，使之重叠而不混合，放置后观察两液界面上是否出现红紫色环，若不明显，可于水域中微热。

5、 醋酸铅反应：

原理：蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下分解形成硫化钠。硫化钠于醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。若加入浓盐酸，就会生成有臭味的硫化氢气体。甲硫氨酸对强碱相对稳定，不发生此反应。

步骤：先向试管中加0.5%的醋酸铅溶液约1ml，然后慢慢滴加10%NaOH溶液，直到产生的沉淀溶解为止。摇匀后，再加蛋白溶液数滴再摇匀，置水浴中加热，溶液变黑。待冷后小心加入数滴浓盐酸。嗅其味（硫化氢），判断是什么物质。