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蛋白质双向电泳过程与体会

双向电泳IEF（sigma）IEF（notIPG）/SDS最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！

IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了）（money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）

BIO-RAD的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为上槽Biorad的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

双向电泳

蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯

毗咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%8-

巯基乙醇），混匀，-20°C沉淀1小时，4°C，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10mMp-巯基乙醇），再于-20C沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10mMp-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20pl（可调）UKS液［9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2%Ampholine（AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10），6%TritonX-100］，37C育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

2蛋白质浓度测定

按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10pl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40pl水及50pl20%三氯乙酸，冰浴30min后，4C，4000r/min离心15min，弃上清，再加入100pl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100plPBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做

2.3.1电聚焦（IEF）

玻管准备

干净玻管（18cmX1.5mm）用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记，垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M的NaOH泡至少1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2,3次水;后用2M的HCL泡至少1个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1个小时，中间换3,4次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.

凝胶制备与电聚焦

灌IEF的配方

为3.09克尿素

1.125ml10%NP-40

1.125ml水

0.735ml30%屏息现案（ACR28.38BIS1.62）

0.15mlAm3.5-10

0.375mlAm5-7

8卫生10%AP

1.8卫生TEMED

用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80pg，上面再小心加入50mmol/LNaOH至管口，不要破坏样品与NaOH的界面。即可进行电泳。电极液为:上槽（负极）为50mmol/LNaOH液，下槽（正极）为25mmol/LH3PO4。按200VX15min，300VX

30min，400VX18h，1000VX1h的程序进行电聚焦。或者直接400V17hr1000V2hrveryimportantthingis跑第一向一定要在保持在37度左右，特别是冬天，我的方法是温控仪控制暖风机在37度暖风机和电泳槽在一个大的纸箱（密封）里.呵呵，应该可以想象得到吧，第一向温度特别重要，不然，电聚焦肯定做不好.

电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200pl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱想哭却又哭不出来，呵呵，