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货号：MS1202 规格：100管/96样

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：

GSH-Px催化H2O2氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生J成^NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体X1瓶，室温保存。

试剂二：粉剂X1瓶，4°C保存。

试剂三：液体X1支，-20C保存。

混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一20mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。（当天用完）

试剂四：液体X1瓶，4C保存。

粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）:试剂一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入血1试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4C离心10min，取上清置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4C,离心10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接测定。

GSH-Px测定操作：

分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

混合试剂在25C或者37C（哺乳动物）水浴中预热30min。

空白管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20pL蒸馏水、160^L预热的混合试剂，20

ML试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A空1和A空2。

△A空白管二A空1-A空2。

测定管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20mL上清液、160mL预热的混合试剂，

20mL试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A测1和A测2。

△A测定管二A测1-A测2。

GSH-Px活性计算：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） .按蛋白浓度计算

GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px（nmol/min/mgprot）=［（AA测定管-△▲空白管）：￡:dXV反总X109】：（CprXV样）：T=536X（^A测定管-AA空白管）：Cpr

（2） .按样本质量计算

GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px（nmol/min/g）=［（△A测定管-AA空白管）：￡:dXV反总X109］^（WXV样：V样总）：T=536X（^A测定管-AA空白管）：W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px（nmol/min/104cell）=［（△A测定管-AA空白管）：￡:dXV反总X109］：（细胞数量XV样：V样总）-FT=536X（△A测定管-AA空白管）：细胞数量

（4） 按液体体积计算

活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px（nmol/min/mL）=［（^A测定管-AA空白管）：￡:dXV反总X109］^V样：T

=536X（△A测定管-AA空白管）

￡:NADPH摩尔消光系数6.22X103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200^L=2X10-4L；106：1mol=1X106Pmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W:样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20pL=2X10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。

使用96孔板测定的计算公式如下

（1） .按蛋白浓度计算

GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每ng蛋白每分