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免疫组织化学在病理诊断中的应用范围1.肿瘤诊断：未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。2.淋巴瘤的诊断：鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。第159页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素〕4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否〕6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓〕7.细针穿刺（细胞学诊断〕第160页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三8.部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测（ER，PR〕10.肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后12.病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等〕第161页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三免疫组织化学在病理诊断中存在的不足1.与分子生物学等技术相比，范围有限2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常常可表达多种肿瘤4.免疫组织化学标准化问题第162页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三第163页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三第164页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三第165页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三2）4％多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。3）戊二醛~多聚甲醛缓冲液：适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。4）其它：如PLP液（过碘酸~赖AA~多聚甲醛固定液）、丙酮及醇类、锇酸等。第127页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三2．固定注意事项：1）固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好；B.最大限度保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。2）组织块的大小：1.5cm×1.5cm×0.5cm为宜。3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时可放置在4℃冰箱。5〕固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。第128页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三（三）包埋：1.石蜡包埋；2.冷冻包埋；3.环氧树脂包理。（四）切片：1.载玻片的处理：1）清洗；2）涂胶（防止脱片）常用粘附剂：①明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；②树脂胶：也称白胶；③多聚赖氨酸（PLL）；④商品化粘附剂。2.切片类型：l）石蜡切片：厚约3～5μm放置37℃温箱烘烤过夜，以减少脱片。2）冷冻切片：2μm。3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。第129页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三四．免疫组化染色过程中的基本技术（一）蛋白酶消化技术进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限度地结合增强特异性染色。1．常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2．消化时间：因组织而异，一般为5~30分钟，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。第130页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三1）非特异染色的控制非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。1．原因分析：组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等；试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。2．消除方法：A.加1抗前加正常血清10~30分，以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非特异性结合。第131页，讲稿共206页，2023年5月2日，星期三B.减少非特异性染色：a免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3％的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30分（若是3％的H2O2甲醇溶液处理5~10分）。b免疫荧光染色时，可用0.01~0.05％伊文思蓝稀释荧光抗体。（二）对照