免疫组化步骤.docx

免疫组化流程

固定

灌流后尽快取出肾脏（1-2分钟内完成），剥除筋膜和其他结缔

组织，取皮质削成薄片，（易于固定液的浸透），置于DwbosyBra液24小时，按照D程序转缸。

包埋蜡块 皮质朝下，组织放平

切片

切2-3微米，用多聚赖氨酸处理的玻片捞组织，用吹风机吹熔组

织。如暂时不做，放-20°冻存，室温放置过久，抗原会丢失

烤片：烤箱60°1小时后尽快放入二甲苯缸脱蜡

脱蜡及水化：二甲苯1 二甲苯2二甲苯3无水乙醇

90%乙醇75%乙醇，每缸10分钟

抗原修复先用微波炉将缓冲液中火3分钟煮沸，再将片子置

入，低火10-20分钟修复抗原

3%Hg室温孵育10分钟，PBST3min洗三次

羊血清室温孵育15分钟，不洗

一抗4°过夜，PBST3min洗三次

生物素化的二抗15分钟，PBST3min洗三次

亲和素一一链霉素一一过氧化物酶复合物即“三抗”15分钟，

PBST3min洗三次

DAB显色

核复染苏木素5min 盐酸酒精1min 氨水5min，染完

冲水，风干

14.中性树胶封片，37°烘片2小时

建议：1、全程尽可能减少干片的机会，以降低非特异性染色

2、抗原修复应在H2O2之后，以便高温时进一步脱蜡

重要步骤说明：

1、 标本固定

固定的目的：

1） 保持组织细胞原有的形态结构

2） 使组织硬化

固定的优、缺点：

优点：使组织细胞的形态结构得到保持

缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损

2、 脱蜡及水化

这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。水化用梯度乙醇（由高到低即无水乙醇---90%---75%）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

3、 抗原修复

抗原修复的原因：

固定液中的醛基与抗原蛋白的氨基酸残基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍，再则由于分子间的交联形成的网格结构，可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露，这些均可造成假阴性的染色结果。因此，用醛类固定剂固定的组织，除非特殊说明，均应常规做抗原复。

修复方法：

常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。需要根据抗体说明书的要求，选择最为合适的修复方法。我们选用的抗体一般用PH6.0柠檬酸盐缓冲液微波修复。注意微波修复后自然冷却30min左右（修复液的温度达室温即可）。

4、 细胞组织通透

目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用

TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用。在免疫组织化学（＞10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。

5、 灭活内源性过氧化物酶和生物素

在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min;用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用。过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

6、 血清封闭

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

7、 抗体的孵育

一抗孵育条件很重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4°、室温、37°，其中4°效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37°1-2h,4°过夜。二抗孵育条件：二抗一般室温或37°30min-1h或者遵照试剂盒说明。

8、 抗体稀释

其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。

9、 切片清洗

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，此外PBS+Tween-20能增强洗涤效果的同时，还能使切片不容易干片，

而且能节省试剂。（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。中性及弱碱性条件（PH7-8）有利免疫复合物的形成，而酸性条件则有利其分解；低离子强度有利免疫复合物的形