免疫组化染色体会.docx

本次染色出现问题:

（1） 操作时间过长到时干片时间长，滴加抗体时覆盖不完全，用枪头辅助覆盖不可在切片区操作，否则切片会出现划痕；

（2） 载玻片的背景较脏，操作前需烤箱脱蜡（45度15min）；浸泡的液体如果放置时间过长，需重新配置；

（3） PAS染色失败，分析原因可能如下：1）加入高碘酸溶液前放置在PBS中，未

用蒸馏水泡洗；2）高碘酸溶液氧化时间可适当延长，本次染色用了10min；3）使用雪夫试剂事未提前半小时在室温下放置，且染色结束后流动自来水冲洗时可能水流过大，下次操作时应把水流调小。

（4） 中性树胶封片时气泡较多，且应等其凝固较完全时才观察。

（来自网上）

严格意义上来说，盖玻片的处理过程是同载玻片一样的，即一片一片（避免叠合）放入酸液中，浸泡过夜，次日取出后，用自来水轻柔的将酸液冲洗干净，同时洗去上面残留的一些渣滓后，再浸泡在洗涤液中过夜，次日取出后，用自来水轻柔的冲洗片子，将上面残留的一些斑点和油渍冲洗干净后，再浸泡在75%的酒精中，4小时后取出，竖立放在切片盒中晾干，备用。由于普通的盖玻片很小很薄，所以在处理过程中应轻拿轻搓，同时可在光线下查看洗涤效果，确认盖玻片平滑、洁净、没有污点、没有划痕后方可使用，否则，应重新洗涤。事实上，盖玻片处理的好坏直接影响到拍相效果，甚至直接关系到实验的成败，本人以前吃过这个苦，呵呵。当然，有些盖玻片上面是一些天然的划痕和斑块，这是没有办法处理的，也处理不干净，碰到这种情况，只有抛弃不用。

至于你染的片子在显微镜下观察总显得有些模糊，不是那么色彩分明，总像遮着一层云雾。出现这种情况的原因，除了脱水不充分之外，我个人认为，原因可能是：

1、 封片前，片子没有完全风干，致使组织中残留水分

2、 中性树胶中的二甲苯含量低或者中性树胶滴到组织片上后，没有及时盖上盖玻片，致使盖玻片和载玻片之间有空隙，中间有空气残留。

3、 盖玻片盖的不严，树胶中的二甲苯大部分已经挥发。致使染色后的片子模糊而没有光泽。

4、 封片后的玻片没有于干燥暗处保存。

我个人以前遇过相似的情况，后来上述这些原因逐步改进后，封片后的片子镜检时图像清晰度很好。

另外，滴加封片剂时，只需用枪头蘸一滴，滴在片子的一角，然后将盖玻片和载玻片一侧成45度，将盖玻片盖下即可。中性树胶会自动均匀覆盖片子，切忌用镊子在盖玻片上挤压，否则容易出现斑痕。

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2015.4.27

4.26-4.27做了8张片子，那个一张脱蜡后组织量少；

烤片时间：70OC2h

脱蜡：二甲苯30min

脱水：553333

抗原修复：采用微波修复方法，抗原修复液（柠檬酸盐）煮沸后停火，放入切片，再次煮沸后停火7min,重复3次。

过氧化物酶灭活：15min;

BSA封闭：15min

一抗孵育：4C过夜（18:00-次日8:00）,CD34按1:100稀释用。

二抗孵育：室温B液+C液共30min

DAB显色：按1：20配DAB工作液，现配现用，在显微镜下显色，镜下到血管结果呈棕色或本底变棕色，即停止显色（整个过程约10s）。

PAS染色：高碘酸溶液（每片40pL）染色7-8min（因切片多，平均染色时间7.5min）,流水下冲洗2min;避光染雪夫试剂（每片40pL）（15min），流水下冲洗2min，蒸馏水泡洗10min;

苏木素复染：30s，流水下冲洗5min;

结果：1、CD34染色效果尚可，有些区域未染上；2、PAS染色仍然过浅，中央区域染色较周围深；

体会：1、无论是CD34还是PAS染色均存在切片组织染色布均匀现象，与抗体孵育时未擦干切片周围的水迹有关，导致浓度下降和试剂区域性流动有关；2、PAS染色仍需改善，，先做以下改变：1、一次切片数量减为4片（时间控制较好）；2、无论滴加何种试剂，切片周围水迹需擦干；3、高碘酸试剂可以增加至每片50pL,且高碘酸试剂使用前先在常温下放30min；4、继续避光染雪夫试剂15min;5、凡涉及流水下冲洗步骤，水势不可过大，保持水流动就好。