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免疫磁珠分离阳性杂交瘤细胞株的可行性

1、 免疫磁珠的性质

免疫磁珠由三部分组成，核心是金属小颗粒（Fe2O3、Fe3O4）,核心的外层包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），最外层是功能基层，如氨基（-NH4）、竣基（-COOH）、羟基（-OH）。磁珠是均匀、球形、具有超顺磁性及保护性壳的粒子。大小和形状的均一性，可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，它的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合超顺磁性可使磁珠置于磁场时，显示其磁性，从磁场移出时，磁性消除、磁珠分散保护性壳可防止金属微粒漏出［1］。根据磁珠功能基结合的免疫配基不同分为：包被一抗的磁珠、包被二抗的磁珠、未包被的磁珠和包被抗生物素的磁珠。

2、 免疫磁珠分离技术的原理

免疫磁珠的功能基团可结合活性蛋白质（如抗体、抗原），利用磁珠上的抗体或抗原与相应的抗原或抗体发生特异性结合，形成免疫磁珠-抗体-抗原的复合物，这种复合物在磁场的作用下，发生力学移动，使复合物与其它物质分离，达到分离纯化的目的⑵。

3、 免疫磁珠的应用

3.1免疫检测

在免疫检测中，免疫磁珠作为固相载体，磁珠上的抗体与抗原特异性结合，形成抗原-抗体-磁珠复合物，在磁场的作用下，使特异性抗原与其它物质分离，起到了提纯与富集的作用，克服了放射免疫和酶联免疫检测的缺点。这种分离检测方法具有灵敏度高，特异性强等优点。磁珠标记的氯霉素直接竞争ELISA方法比常规直接竞争ELISA检测灵敏度提高50倍，达到0.002ng/mL［3］。此外，免疫磁珠在病原微生物的检测方面也起了重要的作用，例如，能快速、准确的检测水中

弓形虫⑷的情况。

3.2细胞分离

早在20世纪80年代初期,Ugelstad就提出用磁性微粒分离细胞，后由挪威Dynal公司制成免疫磁珠出售，可用于各种细胞的分离。使用IMB进行分离细胞有两种方式:直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法，称为阴性分离。免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞，如红细胞⑸、外周血嗜酸/碱性粒细胞，神经干细胞，造血细胞we、T淋巴细胞W］、丫。T淋巴细胞，人类关节滑膜细胞urn,树突状细胞，内皮细胞［12］、及多种肿瘤细胞等。此外，根据磁珠与细胞结合的方式分为:直接法和间接法分离，如下图：

A直接法X寸T细胞进行分类 B间接法对T细胞进行分离

3.3生物大分子纯化

免疫磁珠的基质上固相化抗体或抗原后，形成特异性吸附后，利用磁性分离，可分离和纯化相应的生物大分子。为蛋白质、DNA、RNA、DNA结合蛋白及mRNA等的分离提供载体［13,14］。

4、免疫磁珠分离阳性杂交瘤细胞株的原理

免疫磁珠偶联特异性抗原，与杂交瘤细胞混合孵育，利用抗原-抗体特异性结合这一特性，阳性杂交瘤细胞与免疫磁珠结合，在其周围形成“玫瑰花型”结构，经过磁性分离，洗涤，得到阳性杂交瘤细胞［EM］。

免疫磁珠筛选

磁

常规ELISA筛选

5.1细胞融合

按照目前常规方法，脾细胞与sp2/0细胞在PEG的作用下融合。

5.2HAT培养筛选

细胞融合后，利用HAT培养基在75cm2的细胞瓶中培养，培养3天后，利用

包被特异性抗原的免疫磁珠进行阳性细胞株分离。

5.3免疫磁珠筛选阳性细胞株

免疫磁珠与抗原偶联

具体方法参考免疫磁珠试剂盒。

杂交瘤细胞的洗涤

收集杂交瘤细胞，1500rpm离心3min，利用无血清培养基洗涤2次，最后利用无血清培养基重悬计数。

免疫磁珠筛选

免疫磁珠与杂交瘤细胞的比例控制在10:1,放在4°C共同孵育2h(或者37°C共同孵育30min)，此过程需要不断的轻轻摇动。磁性分离，用DEME洗涤2次。

细胞克隆

分离出的杂交瘤细胞在显微镜下计数，利用有限稀释法进行细胞克隆，稀释到0.5-1个细胞/孔，转移到96孔细胞培养板中培养。

ELISA检测

细胞培养7天后，利用ELISA进行检测，挑取亲和力高的单克隆阳性细胞株，转移到24孔中培养。

细胞扩大培养

细胞扩大培养，方法同常规方法，最终制备腹水。

6、免疫磁珠筛选法的优点

节约时间：比常规ELISA筛选节约10-20天。

得到更多的阳性细胞株：HortonW］利用对比试验证明，利用免疫磁珠筛选法建立的阳性细胞株比常规ELISA筛选法更多。

阳性细胞株分泌抗体的亲和力更高：Horton［16］利用对比试验证明，利用免疫磁珠筛选法建立阳性细胞株分泌抗体的亲和力比常规ELISA筛选法的更高。

节约成本：不经过96孔细胞培养板培养，直接免疫磁珠筛选阳性细胞株。

实验过程更加简单。

全自动磁性分选仪器

磁性处理过程原理

厩性颗粒被喂附在 懑性满粒蹄敞 制备好的悬^酒

套管头的表面

旗性颗粒聚集

7.1磁棒工