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免疫组化实验步骤

实验目的：检测某抗体在某组织中的表达情况。

实验原理：免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。

实验用品：烤箱、微波炉、显微镜、37°C温箱、通风橱、加样器、滴管、玻片、二甲苯、乙醇（100%、85%、75%）、蒸馏水、0.01M柠檬酸盐、3%H2O2、IxPBS、10%羊血清、DAB、苏木素（中衫金桥）、1%盐酸酒精、淡氨水、中性树胶，一抗，二抗

试剂配制：

1、 1xPBS（PH7.2?7.4）

TOC\o1-5\h\z磷酸二氢钠 1.5g

磷酸氢二钠 22g

NaCl 42.5g

1000ml蒸馏水搅拌溶解，定溶至5000ml

2、 10%羊血清

100%羊血清 100叫

PBS 900gl

3、 0.01M柠檬酸盐缓冲液

柠檬酸 0.8g

柠檬酸三钠 6g

1000ml蒸馏水搅拌溶解，定溶至2000ml

4、 1%盐酸酒精

乙醇 300ml

盐酸 4ml

蒸馏水至400ml

5、 淡氨水

蒸馏水 495ml

浓氨水 5ml

100gl900gl6、 3%H2O2

100gl

900gl

30%H2O2

甲醇

7、DAB（现用现配）

取ImlDAB缓冲液于离心管中，加入1滴DAB显色剂，混匀

实验步骤：

1、 将载玻片放入烤箱中，60C1小时。

2、 室温冷却载玻片。

3、 脱蜡

二甲苯浸洗3次，每次10分钟。

4、 水化

梯度乙醇水化，100%—85%—75%，每次3分钟。

5、 蒸馏水浸洗3次，每次3分钟。

6、 抗原修复

将玻片浸入盛有500ml0.01M柠檬酸盐溶液的烧杯中，保鲜膜覆盖，微波高火加热至沸腾，调至解冻温度，12分钟。

7、 室温冷却。

8、 蒸馏水浸洗3次，每次3分钟。

9、 3%H2O2浸洗10分钟，消除内源性过氧化物酶。

10、 蒸馏水浸洗一次，3分钟，PBS浸洗2次，每次3分钟。

11、 封闭

100印10%羊血清室温封闭10分钟。

12、 一抗孵育

取100即各种抗体加在组织上，4°C过夜。

13、 复温

将玻片从冰箱中取出，复温至室温。

14、 PBS浸洗3次，每次3分钟。

15、 二抗试剂1孵育

各取100即抗体加在组织上，37。孵育，20分钟。

16、 PBS浸洗3次，每次3分钟。

17、 二抗试剂2孵育

各取100即二抗试剂2加在组织上，37°C孵育，30分钟。

18、 PBS浸洗3次，每次3分钟。

19、 DAB显色

取100即稀释好的DAB加在组织上，注意观察，染色后自来水冲洗。

20、 苏木素染色3分钟。

21、 自来水冲洗，1%盐酸酒精浸洗，分化多余的苏木素，自来水浸洗。

22、 氨水返兰浸洗3分钟。

23、 自来水稍浸洗。

24、 脱水

梯度酒精脱水75%—85%—100%，各3分钟。

25、 透明

将玻片放入二甲苯透明，观察组织透亮，无气泡。

26、 封片

滴加适量中性树脂于玻片上，盖上盖玻片，避免气泡出现。

注意事项：

1、 实验各步骤保持玻片不干燥。

2、 自来水冲洗时注意保护组织。