原核表达系统的选择和高效表达策略.pptxVIP

微生物基因工程;教学内容

一、PCR引物的设计与实验操作技巧；

二、基因组文库的建立与筛选；三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中

的应用；四、原核表达系统的选择和高效表达策略；

五、真核表达系统的选择和高效表达策略。;四、原核表达系统的选择和高效表达策略;原核表达系统的优点

1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；

2、外源基因表达产物的水平高(如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%)；

3、基因背景和表达特性清楚。;大肠杆菌表达系统

自20世纪70年代以来,大肠杆菌一直是基因工程中应应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组

时代以来,有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基

因表达的要求更高,

这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。;大肠杆菌表达系统的优缺点;大肠杆菌表达系统的操作流程

大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下：获得目的基基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一

步检测。;大肠杆菌表达系统的基本概念

首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。

表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。

但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。;大肠杆菌表达系统的基本概念;大肠杆菌表达系统的基本概念;大肠杆菌表达系统的基本概念

核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意。;大肠杆菌表达系统的几种表达方式;大肠杆菌表达系统的几种表达方式;提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略;大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子;大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子;大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子;大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子;大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子;常用的几种大肠杆菌表达系统

1、GE（原安玛西亚）-pGEX系列，特点：使用该系列载体可以很方便进行下一步重组蛋白的纯化。;GE（原安玛西亚）-pGEX系列;Invitrogen-Champion?pETExpressionSystem等四个系列;InvitrogenpET100/D-TOPO载体图谱;Novagen公司-pET表达载体序列

Novagen公司（Merck的子公司）出品了多种原核表达载体系列，其中的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体。;Novagen公司的pET表达载体系列;Novagen公司的PET32a表达载体图谱;Novagen公司的pET表达载体选择;Novagen公司的大肠杆菌菌株选择;Novagen公司的大肠杆菌菌株选择;原核表达需要考虑的问题

在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿

主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。;大肠杆菌表达系统的高效表达策略;使用pET表达系统的常见问题分析;原核表达常见的几个问题及回答（1）;提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略;原核表达常见的几个问题及回答（2）;原核表达常见的几个问题及回答（3）;原核表达常见的几个问题及回答（4）;原核表达常见的几个问题及回答（5）;原核表达常见的几个问题及回答（5）;原核表达常见的几个问题及回答（6）;重组质粒和菌株的保存建议;