分子生物学试验.PPTVIP

实验一规仪器设备及操作简介TUBES实验一规仪器设备及操作简介PE/乳胶手套实验一规仪器设备及操作简介PARAFILM实验一规仪器设备及操作简介Tips实验一规仪器设备及操作简介过滤器实验一规仪器设备及操作简介3、分子生物学实验常规仪器和设备的操作观看录像教师示范实验二基因组DNA的制备与分析实验二基因组DNA的制备与分析实验二基因组DNA的制备与分析一、基因组DNA的制备【实验目的】1、学习基因组DNA分离的原理2、掌握动物基因组DNA提取的方法3、了解植物基因组DNA提取与动物基因组DNA提取方法的不同【实验原理】将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。破坏细胞膜、核膜，SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，（氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡）得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，Southernblot分析。实验二基因组DNA的制备与分析DNA酚抽提法示意图实验二基因组DNA的制备与分析【实验器具】高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、Tip头、记号笔等。【试剂】1、组织细胞裂解液100~200μg/ml蛋白酶K10mmol/LTris－Cl（pH8.0）0.1mol/LEDTA(pH8.0)0.5%SDS20μg/mlRNaseA2、平衡酚（用0.5mmol/LTris－Cl饱和，pH8.0），3、氯仿/异戊醇（24：1v/v）4、3mol/L乙酸钠（NaAc，pH5.2）5、冷无水乙醇（AR）6、70%乙醇（-20℃静置）7、TE缓冲液（10mmol/LTris－Cl、1mol/LEDTA(pH8.0)实验二基因组DNA的制备与分析【操作步骤】实验二基因组DNA的制备与分析1、根据样品类型，采用以下方法之一作为步骤1：a、细胞样品贴壁培养细胞约107个，用冰预冷的Tris缓冲液（TBS，见附录）冲洗2次，以细胞刮棒收集于TBS中。离心1500g×10min，弃上清。或用胰酶消化后再离心收集，以TE（pH8.0）重悬细胞离心洗涤1~2次，悬浮生长的细胞，于4℃1500g离心10min收获细胞，以TBS重悬细胞离心洗涤1~2次。b、组织标本取新鲜或冰冻组织块0.3~0.5cm3，剪碎，加TE缓冲液400μl进行匀浆，转入1.5mlEp管中，加等体积2×组织细胞裂解液混匀。或从液氮中取出组织于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎，将粉末转入1.5mlEp管。（液氮操作，应注意保护眼、手以免冻伤）。c、血液标本新鲜血液与ACD抗凝剂按6：1进行混匀，0℃以下可保存数天或-70℃长期冻贮、备用。ACD抗凝剂配方：柠檬酸0.45g柠檬酸钠1.32g右旋葡萄糖1.47g抗凝血离心1500g×10min，弃上清（血浆）（冷藏血液于水浴中融化后用等体积PBS稀释，离心3500g×15min弃上清）。实验二基因组DNA的制备与分析2、将以上各种来源的组织加组织细胞裂解液400~500μl，混匀于37℃温浴12h~24h，或37℃温浴1h后转50℃水浴3h（裂解细胞、消化蛋白），并经常摇动。3、反应液冷却至室温加500μl平衡酚，缓慢颠倒10min混匀。4、离心5000g×15min，转上层水相于新Ep管中，（必要时重复酚抽提一次）。5、加氯仿/异戊醇（24:1）450μl，混匀后离心5000g×10min。6、转上层水相于新Ep管中，加1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置-20℃1h。7、离心10000g×15min，弃上清。8、以70%冷乙醇洗涤1~2次，真空抽干或自然吹干，（勿使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解，加热可促其溶解）。9、沉淀溶于100μl缓冲液，置-20℃保存。实验二基因组DNA的