溶酶体相关膜蛋白基因LAMP2突变致骨骼肌糖原累积作用的分子机制.pdf

摘要

摘要

研究背景：

编码溶酶体相关膜蛋白（Lysosomalassociatedmembraneproteingene,

LAMP2）的LAMP2基因是Danon病的致病基因。Danon病是集心肌病、骨骼肌

病、神经障碍等多系统功能障碍的高致残、致死性疾病，主要病理特点为细胞

内糖原累积和自噬体形成。研究发现，肌肉细胞内的糖原累积可能与葡萄糖转

运蛋白4（glucosetransporter4,GLUT4）功能相关，肌肉对葡萄糖摄取的急性

调节作用依赖GLUT4的膜定位。GLUT4在其细胞质-膜之间的循环通过囊泡运

输实现。运输GLUT4的细胞囊泡上存在多种调节蛋白，其中Rab（Ras

homologousfrombrain）蛋白家族在GLUT4的囊泡运输中发挥关键调节作用。

LAMP2A蛋白是分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy,CMA）

的关键调控蛋白。在CMA过程中，分子伴侣热休克蛋白70（Heatshockprotein

70,HSC70）可特异性识别具有“KFERQ”五肽序列的底物蛋白，促进底物去折叠

并被溶酶体膜上的LAMP2A蛋白识别，继而进入溶酶体腔被降解，而Rab10具

有“KFERQ”五肽序列。本团队在一位Danon病患者中发现LAMP2Y223*突变，并

首次发现其在心肌中可引起糖原累积作用。然而，该突变对骨骼肌的影响未知。

研究目的：

本研究构建Lamp2Y228*突变基因敲入小鼠，首次从体内、体外实验探索

LAMP2Y223*突变是否在骨骼肌内引起糖原累积作用，并探究GLUT4-Rab10在其

中发挥的作用。

研究方法：

1、动物模型：本研究采用以往构建的携带Lamp2Y228*突变的KI小鼠模型

（KI-Lamp2Y223*），以6-8周龄的野生型小鼠组（WT组）或Lamp2Y228*突变型小

鼠组（KI组）为对象，将WT组小鼠的性别、年龄与KI组相匹配进行实验。

2、观察骨骼肌糖原累积表型：（1）苏木素-伊红（HE）染色观察人与小

鼠骨骼肌组织结构；（2）过碘酸-雪夫（PAS）染色观察骨骼肌糖原累积情况；

（3）马松染色观察骨骼肌组织纤维化情况。

3、探索骨骼肌糖原累积的机制：（1）通过WesternBlot实验在体内、体外

II

摘要

验证细胞浆、膜的GLUT4、Rab10和LAMP2蛋白的表达；（2）通过免疫荧光

实验观察LAMP2A的表达及GLUT4的膜定位；（3）葡萄糖摄取实验则用来验

证LAMP2突变对骨骼肌细胞糖代谢的影响。

4、探索Rab10自噬降解的机制：（1）利用自噬激活剂平衡盐溶液（EBSS）

和自噬阻断剂氯喹（Chloroquine,CQ）处理小鼠成肌细胞，使用WesternBlot实

验检测Rab10的表达情况，明确Rab10是否通过自噬溶酶体途径降解；（2）利

用CMA自噬激活剂6-氨基烟酰胺（6-Aminoincotinamide,6-AN）和巨自噬抑制

剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）处理细胞，用WesternBlot实验检测

Rab10表达情况，明确Rab10是否通过CMA途径降解；（3）免疫共沉淀技术验

证Rab10是否与CMA的关键分子LAMP2A和HSC70存在相互作用。

研究结果：

1、LAMP2Y223*突变可致骨骼肌糖原累积作用

（1）PAS染色显示，Danon病患者的骨骼肌组织存在糖原累积现象；HE

染色与马松染色无明显异常；

（2）PAS染色显示，KI小鼠与WT小鼠相比出现明显的糖原累积；马松染

色提示KI小鼠的骨骼肌纤维化增加；HE染色无明显差异；

2、KI-Lamp2Y223