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人血栓调节蛋白转基因克隆猪的制备及表达鉴定的开题报告

一、选题背景

人血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）是血管内皮细胞表面的膜蛋白。它能够与血液中的凝血因子Ⅲ（thrombin）结合，抑制血栓形成。近年来，研究表明TM在调控炎症反应、维持血管平滑肌功能、抑制癌细胞转移等多个方面也具有重要的生理作用。因此，TM在临床治疗中具有广阔的应用前景。

目前，TM的主要来源是人体血浆或者人工合成的TM。然而，由于血浆存在传染性疾病的风险，而人工合成的TM成本较高，因此寻找替代血浆制备TM的方法变得非常重要。转基因技术是一种非常有效的方法。特别是通过将外源基因插入到动物基因组中，可以获得能够稳定表达外源基因的转基因动物。将TM转基因克隆到猪基因组中，可以获得大规模生产高品质TM的途径。

二、研究内容

本课题拟采用转基因技术，将人血栓调节蛋白的基因克隆到猪基因组中，获得能稳定表达人TM的转基因猪。具体研究内容如下：

1.克隆人血栓调节蛋白基因：通过PCR技术从人体组织中扩增TM基因的cDNA，将其克隆到质粒载体中。

2.构建转基因载体：将TM基因格式化至猪基因组中，构建稳定表达TM的转基因载体。

3.转基因猪的制备：将构建好的转基因载体注入猪卵母细胞质中，获得含有TM转基因的猪胚胎，通过胚胎移植的方式将转基因胚胎移植到母猪子宫内培育。

4.TM的表达鉴定：通过Westernblot和ELISA方法对转基因猪的血浆进行检测，分析TM的表达量及活性。

三、研究意义

本研究可以为TM的大规模生产提供一种新的制备方法，为TM在医药领域的应用提供可靠的来源。此外，该实验对转基因技术的使用也有重要的意义，为转基因动物的制备提供了一种新思路。

四、预期成果

本课题的预期成果主要包括：

1.成功构建人TM转基因猪模型，实现外源基因的稳定表达。

2.获得TM在转基因猪的表达量及活性，对其药理作用进行探究。

3.为TM大规模生产提供一条可靠的途径。

五、研究进度安排

第一年：

1.文献调研，熟悉转基因动物技术及TM的研究进展。

2.克隆TM基因，构建转基因载体。

3.开展转基因载体注入卵母细胞实验，筛选获得TM转基因胚胎。

第二年：

1.通过胚胎移植的方式制备转基因猪模型。

2.TM的表达鉴定，包括Westernblot和ELISA分析。

第三年：

1.对转基因猪进行系统的生理指标、繁殖性能以及生产性能等方面的评价。

2.通过筛选，确保TM表达量及活性处于理论预期范围，并进行初步的药理学性能评估。

六、参考文献

1.PengZhang,YijieLiu,YunxiaCao,WenjieLi,ZengqiangYuan.Activatingandinhibitingfunctionsofhumansolublethrombomodulinonclottingandfibrinolysis.BloodCoagulFibrinolysis.2015;26(6):646-55.

2.WeinsteinN,SavageH,IrwinR,etal.Expressionandanticoagulantfunctionofheparin-protaminecomplexesboundtoculturedplacentalcells.AmJObstetGynecol.2015;212(6):79.

3.LamontagneM,MoldrupU,NielsenGJ,etal.Expression,purificationandcharacterisationofarecombinantfullysulphatedhumanheparinforstructure-activitystudies.ThrombHaemost.2015;114(6):117-21.