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实验八CTAB法提取植物基因组DNA及电泳检测

实验目的学习从植物组织中提取DNA的方法。主要用于Southern杂交、PCR扩增、RFLP及RAPD分析以及基因组克隆，分离纯化目的基因，植物基因转化（提供供体DNA）等。

附：植物基因组DNA的提取

及电泳检测

实验目的学习从植物组织中提取DNA的方法。主要用于Southern杂交、PCR扩增、RFLP及RAPD分析以及基因组克隆，分离纯化目的基因，植物基因转化（提供供体DNA）等。**实验原理一般生物体基因组DNA约107-8bp，制备基因组DNA是研究基因组结构和功能的重要步骤。利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；有效制备基因组DNA的方法都要考虑两个原则：防止和抑制内源DNase对DNA的降解；尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程中各种DNase无法活动；由于对组织破碎程度可以很高且均匀，故当加入含螯合剂（如EDTA、柠檬酸，通常10-100mM）的提取液后，DNase所需的辅助因子Mg２＋或Mn２＋尚未开始作用已被螯合剂掩盖；EDTA抑制DNA酶活性。加入的去污剂一方面可以破坏细胞膜，使大分子DNA释放到提取缓冲液中，另一方面也可以保护DNA受内源核酸酶的降解;为尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，则当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作一定要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。CTAB方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。再用氯仿抽提去除蛋白，得到的DNA用异丙醇或乙醇沉淀。而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.研钵2.高速台式离心机3.微量取液器4.恒温水浴5.电泳装置（二）材料新鲜豌豆苗或新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料（三）试剂(1)2×CTABDNA提取液：100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表），2%CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。(2)氯仿或氯仿/异戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)100%乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇(6)70%乙醇实验程序1.在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB和20μlβ-巯基乙醇,65℃预热。2.嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温30-60min，并不时轻轻转动试管。（可用打碎机用钢珠打碎）注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻；而且粉末应在化冻前转移否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀10min，室温下12000rpm离心10min，移上清至另一新管中。向管中加入1/100体积的RNaseA溶液，置37℃20-30min。加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30min或-80℃放置10min，12000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O或TE中。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；提取液中的十二烷基肌酸钠溶解膜蛋白，破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀。EDTA抑制DNA酶活性。再用氯仿抽提去除蛋白，得到的DNA用异丙醇或乙醇沉淀。一般生物体基因组DNA约107-8bp，制备基因组DNA是研究基因组结构和功能的重要步骤。有效制备基因组DNA的方法都要考虑两个原则：〈1〉防止和抑制内源DNase对DNA的降解；