实验一-肝脏DNA的提取.pptVIP

肝脏DNA的提取实验目的掌握DNA提取的基本原理熟悉DNA提取的操作步骤掌握离心技术一般过程破碎细胞提取核蛋白DNA核蛋白和RNA核蛋白分离蛋白和核酸分离原则低温：抑制DNA酶的活性操作柔和：防止DNA断链DNA分离纯化的原理DNA或DNP在0.14MNaCl盐溶液中溶解度很低，而RNA则溶于0.14MNaCl盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取脱氧核糖核蛋白复合物-DNP后，必须将其中蛋白去除其中蛋白质部分可用SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶）。进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中。利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA从溶液中沉淀出来。离心机的使用平衡对称放入，盖上盖设定转速、时间离心开始完全停止后开盖实验步骤1、取新鲜猪肝4g，用0.14mol/LNaCl—0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10ml0.14mol/LNaCl—0.15mol/LEDTA溶液，置匀浆器中研磨。（初步破碎细胞）。（已做）2、取一支10mlEP管，装入糊状物（基本装满），离心5min（10000rpm），弃去上清液沉淀用0.14mol/lNaCl-0.15mol/lEDTA溶液洗2次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品3、向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl—0.15mol/LEDTA溶液5ml，分装于2支10mlEP管，然后每管滴加25%SDS溶液1.0mL，边加边振荡。加毕，置60℃水浴10min（不停振荡），直至溶液变得粘稠并略透明，取出冷却至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。4、每管加入5mol/lNaCl溶液1mL，蝴蝶形振荡5min。加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液，蝴蝶形振荡10min，离心10min（4000rpm）。此步骤后溶液分三个相：上层水相（DNA）；中层变性蛋白质相；下层有机相。5、吸出上清液，弃去沉淀。向上清液中缓慢加入1.5—2倍体积的95%乙醇，DNA沉淀析出，［离心（4000rpm）10分钟］用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA取4g猪肝，预冷NaCl-EDTA溶液洗两次↓洗净的猪肝剪碎，加10mlNaCl-EDTA溶液↓在匀浆器中磨碎取一支10mlEP管，装入糊状物（基本装满），4℃,10000rpm离心5min↓↓往沉淀中加入NaCl-EDTA溶液洗两次，同上离心→将沉淀悬于5mlNaCl-EDTA溶液中，分装于两支10mlEP管边振荡边缓慢加入1ml25%SDS溶液↑60℃水浴10min（不停振荡），↑5mol/lNaCl溶液1mL，蝴蝶形振荡5min。↑↑加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液，蝴蝶形振荡10min，离心10min（4000rpm）。→小心吸出上层清液↓加入1.5—2倍体积的95%乙醇↓离心，4000rpm，10min弃上清，加入0.1M/L1mlNaOH溶解↓思考题：核酸提取中SDS、氯仿-异戊醇各有什么作用？核酸提取过程中最重要的原则是什么？酚:氯仿:的目的是沉淀蛋白质原理如下：酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。水相异戊醇的目的是减少抽提过程中的泡沫产生，原理如下：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生酚:氯仿:的目的是沉淀蛋白质原理如下：酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。水相异戊醇的目的是减少抽提过程中的泡沫产生，原理如下：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生