SN 1460-2004输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1460—2004

输入性蚊类携带西尼罗病毒与

圣路易脑炎病毒的检测方法

DetectingmethodsforwestnilevirusandSt.Louis

encephalitisvirusinimportedmosquitoes

2004-11-17发布

2005-04-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1460—2004

前言

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人

民共和国陕西出入境检验检疫局负责起草。

本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、黄廷学、闫护森、施惠祥、卢岳云、杨定波。

本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。

1

SN/T1460—2004

输入性蚊类携带西尼罗病毒与

圣路易脑炎病毒的检测方法

1范围

本标准规定了国境口岸输人性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测的生物安全要求、检测

对象、检测方法、结果的报告、阳性结果处置。

本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测和报告，

对口岸发现的蚊类检测西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒也可参照执行。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研

究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准

3.1

输入性蚊类importedmosquitoes

通过入境交通工具、集装箱、货物及行李带入境内的库蚊、伊蚊属

3.2

西尼罗病毒westnilevirus,WNV

为西尼罗热的病原体，属黄病毒科，黄病毒属。电镜下呈球形，有囊膜，40nm～60nm的20面体对

称型单股正链RNA病毒，约1000bp~11000bp.

3.3

圣路易脑炎病毒St.Louisencephalitisvirus,SLEV

为圣路易脑炎的病原体，属黄病毒科，黄病毒属的RNA病毒。

4检测对象

输入性蚊类。

5生物安全要求

下列操作必须在生物安全3级(BSI,3)实验室中进行：

用蚊胸腔接种的方法分离病毒

收集或浓缩病毒或其培养产物

可能产生含病毒气溶胶的样品处理：

离心管和离心机转头的封闭和开启，

2

SN/T1460—2004

6病毒核酸分子检测—逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

6.1器材与试剂

6.1.1器材

PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱(-80℃)、

组织研磨器、电动匀浆器、离心机和离心管、倒置显微镜、PCR管、剪刀、镊子。

6.1.2试剂

6.1.2.1水

应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水必须是无RNA酶

的水。

6.1.2.2TaqDNA聚合酶

—20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

6.1.2.3逆转录酶

—20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

6.1.2.4RNA抑制剂(RNasin)

一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。

6.1.2.5dNTP

含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。

6.1.2.6引物

6.1.2.6.1西尼罗病毒引物

浓度为20μmol/L,可根据要求选择其中一对引物，其序列分别如下：

a)引物对1如下：

——上游引物WNENV—forward:5-TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3’

——下游引物WNENV—reverse:5-GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-3’。b)引物对2如下：

——上游引物WN233:5-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCGTTCTT-3’;

——下游引物WN640c;5-CAGCCGACAGCACTGGACATTCATA-3’。

c)引物对3如下：

——上游引物WN3’NC—forward:5’-CAGACCACGCTACGGCG-3’;

——下游引物WN3’NC—reverse:5’-CTAGGGCCGCGTGGG-3’。

6.1.2.6.2圣路易脑炎病毒引