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第二章dna重组
第二章DNA重组
DNA重组的概念及意义
¡在自然界，生物体内时刻发生DNA的重组，
呈现出对生物有利或有害的变异。这种重组
不受人们意志控制，重组结果难以预测。
¡基因工程涉及的DNA重组是根据人们的愿望，
进行严密的设计，在生物体外通过人为的
DNA片段化的重新连接，产生新的重组DNA
分子，使其遗传信息发生变化，达到人们希
望的目的。
2.1DNA的组成和结构（略）
2.2天然DNA的制备
¡2.2.1天然DNA的来源染色体
和用途DNA
线粒体病毒和
和叶绿天然DNA噬菌体
体DNADNA
质粒DNA
¡2.2.2天然DNA的提取
准备生物材料
裂解细胞
分离和抽提DNA
1、准备生物材料
选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择
DNA得率最高的生长期。如:
¡大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。
¡植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗，减小淀粉对提取
DNA的干扰。
¡肝脏DNA：要清除胆囊，主要是去除多种高活性的酶。
2、裂解细胞
这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的
关键步骤。
¡原核细胞：用溶菌酶，NaOH和SDS，煮沸，冰冻，超
声波等方法；
¡结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后研
磨，或捣碎机、研钵直接粉碎），再参照裂解原核的方法。
3、分离和抽提DNA
3、分离和抽提DNA
¡提取总DNA：在裂解液中加适量酚／氯仿／异戊醇或氯仿／异
戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀
DNA，再离心。
¡提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体
的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽
提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。
¡提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀，
再调节PH至中性，质粒DNA复性后从沉淀物中释出。
¡除RNA：用RNase水解除RNA，
¡分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中加
适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数
明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）
2.2.2.1大肠杆菌源质粒DNA的提取
碱裂解法*：
¡原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂
中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，
相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当用钾离子
取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，
离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。
¡2.2.3DNA的纯化
2.2.3.1氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法
2.2.3.2离子交换层析法
¡用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA
¡用羟基磷灰石纯化DNA
2.2.3.3琼脂糖凝胶电泳洗脱法
2.2.3.4
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