荧光原位杂交实验.pptVIP

13将玻片自然干燥，PI/antifade复染，盖上盖片。14镜检、照相。第31页,共35页，2024年2月25日，星期天第32页,共35页，2024年2月25日，星期天第33页,共35页，2024年2月25日，星期天第34页,共35页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第35页,共35页，2024年2月25日，星期天关于荧光原位杂交实验原位杂交(Insituhybridization)

1）同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

（1）免疫酶联

（2）荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位杂交的不足之处：

1）不稳定；

2）高背景；

3）曝光时间长；

4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理

第2页,共35页，2024年2月25日，星期天实验的基本原理:FISHisthedetectionofhighlyspecificDNAprobeswhichhavebeenhybridizedtoeitherinterphaseormetaphasechromosomesusingfluorescencemicroscopy.

第3页,共35页，2024年2月25日，星期天DNAforprobeuseislabeledwithfluorescent(directmethod)ornonfluorescentmoleculeswhicharethendetectedbyfluorescentantibodies(indirectmethod).Theprobesbindtoaspecificregionorregionsonthetargetchromosome.Thechromosomesarethenstainedusingacontrastingcolor,andthecellsareviewedusingafluorescencemicroscope.

第4页,共35页，2024年2月25日，星期天第5页,共35页，2024年2月25日，星期天第6页,共35页，2024年2月25日，星期天第7页,共35页，2024年2月25日，星期天**荧光原位杂交的特点：

1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。

**FISH有上述优点的原因：

使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统

标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)

——半抗原报告分子（间接标记）

（2）荧光物质（直接标记）

第8页,共35页，2024年2月25日，星期天FLUORESCENTlabeleddUTPHAPTENElabeleddUTPAMCA-6-dUTPCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-dUTPDinitrophenyl(DNP)-11-dUTP第9页,共35页，2024年2月25日，星期天染色体复染的物质:

PropidiumIodide(PI)（红色）DAPI（兰色）quinacrine（绿色）chromomycineA3（绿色）

第10页,共35页，2024年2月25日，星期天第11页,共35页，2024年2月25日，星期天染色体“原位抑制”杂交（chromosomeinsitusuppression,CISS)

克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。

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