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血涂片制备与染色

血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。

（一）血涂片制备1.载玻片的准备

新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。

使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。2.血涂片制作方法

取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。

涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。

一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。

（二）血涂片染色

染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。

血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法（Wright）、姬姆萨染色法（Giemsa）等。

瑞特（Wright）染色法

为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。

瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。

细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。EAMGILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。RA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl（视染液浓度而定），加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm；天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。所以新配染料RA接近2，随着美蓝逐渐氧化为天青B，RA也相应下降。RA下降到1.3±0.1时即可使用。瑞特染液贮存过程中，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。有人主张在配方中加入甘油30ml，防止甲醇挥发，为了细胞染色清晰。甲醇必须纯净，如甲醇中丙酮含量过多，染色偏酸，使白细胞着色不良。

本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。

姬姆萨（Giemsa）染色法姬姆萨染料由天青和酸性染料伊红组成的复合染料。染色原理、缓冲液与瑞特染色法大致相同。本法对细胞核结构和寄生虫着色较好，结构显示更为清晰，但细胞质和颗粒着色较差。

瑞－姬染色法

瑞特染色液和姬姆萨染色液对细胞进行染色时有各自的显色特征，前者对细胞浆和颗粒着色较好，后者对对细胞核结构显示清晰。因此将瑞特染料和姬姆萨染料混合，甲醇溶解后组成瑞－姬染色液能取长补短，优势互补，其中所使用的缓冲液与瑞特染色法相同。用该混合染